巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)(xi)胞無論是(shi)(shi)在維持機體的(de)(de)(de)(de)生理穩態還是(shi)(shi)斡(wo)旋(xuan)組織的(de)(de)(de)(de)病(bing)理炎(yan)性(xing)(xing)(xing)(xing)，都發揮重要的(de)(de)(de)(de)作用。此(ci)(ci)外，巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)(xi)胞也促進多種(zhong)疾病(bing)的(de)(de)(de)(de)病(bing)理生理學，如(ru)包括癌癥和(he)各(ge)種(zhong)炎(yan)癥性(xing)(xing)(xing)(xing)紊亂(luan)。巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)(xi)胞功能的(de)(de)(de)(de)多樣性(xing)(xing)(xing)(xing)也正如(ru)它起源的(de)(de)(de)(de)復雜性(xing)(xing)(xing)(xing)（當(dang)然(ran)爭(zheng)議(yi)性(xing)(xing)(xing)(xing)更(geng)大），形態的(de)(de)(de)(de)異質性(xing)(xing)(xing)(xing)，表(biao)型(xing)的(de)(de)(de)(de)可(ke)塑性(xing)(xing)(xing)(xing)。因此(ci)(ci)，巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)(xi)胞作為(wei)一種(zhong)具有可(ke)塑性(xing)(xing)(xing)(xing)，多能性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)異質性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞群體,在體內和(he)體外不(bu)同的(de)(de)(de)(de)微環境影響下,表(biao)現出獨特的(de)(de)(de)(de)表(biao)型(xing)和(he)功能，體現的(de)(de)(de)(de)是(shi)(shi)一個在時(shi)間和(he)空間上受一系(xi)列機體免(mian)疫學網絡所(suo)調控(kong)的(de)(de)(de)(de)復雜動態連續性(xing)(xing)(xing)(xing)生物學過程。
為了更(geng)好的研究巨噬(shi)細(xi)胞(bao)功能，設計研究實驗(yan)時，要在(zai)時間上（疾病的發生和發展）和空間上（病灶(zao)的原位，組織，器官）考慮到巨噬(shi)細(xi)胞(bao)的起源，更(geng)新，補(bu)充，形態(tai)，表(biao)型(xing)和功能的連續性，動(dong)態(tai)性和網絡性。
Q1.為什么Clodronate Liposomes（氯膦酸二鈉脂(zhi)質體）是研究巨噬細(xi)胞(bao)功能的(de)利器？
A1：巨噬細胞在免疫(yi)系統(tong)中發揮重要作用。它們主要通過(guo)(guo)可溶性(xing)分子，如細胞因子和(he)趨化因子的介導來調節許(xu)多非吞噬細胞的功能。巨噬細胞還通過(guo)(guo)攝(she)取和(he)消(xiao)化微生物或非自身(shen)顆粒和(he)大分子參(can)與(yu)身(shen)體(ti)的“穩態”。內吞物的消(xiao)化是由(you)其溶酶體(ti)酶介導的。
脂質(zhi)體是人工制備的(de)脂質(zhi)囊泡(pao)，由夾帶水(shui)性隔室的(de)同心磷脂雙層組成。它們可用(yong)于包封溶解在水(shui)溶液中的(de)強(qiang)親水(shui)性分子，例如氯膦(lin)(lin)酸鹽(yan)，一種(zhong)為人類應用(yong)開(kai)發的(de)無毒二(er)膦(lin)(lin)酸鹽(yan)。
注射后，氯膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)脂(zhi)質(zhi)體(ti)起到特洛伊木(mu)馬的作用。巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)(bao)攝取(qu)氯膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)脂(zhi)質(zhi)體(ti)并消(xiao)化脂(zhi)質(zhi)體(ti)膜(mo)。氯膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)不會(hui)(hui)被(bei)消(xiao)化，并會(hui)(hui)留在巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)(bao)內。更多氯膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)將在巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)(bao)中積聚，因為它會(hui)(hui)攝取(qu)和消(xiao)化更多的氯膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)脂(zhi)質(zhi)體(ti)。當氯膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)在細(xi)胞(bao)(bao)內聚集到一定的濃度后，氯膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)會(hui)(hui)通過啟動其程序性細(xi)胞(bao)(bao)死亡(wang)即細(xi)胞(bao)(bao)凋亡(wang)來清除巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)(bao)[1]。
通(tong)過選擇氯(lv)膦酸(suan)鹽(yan)脂(zhi)質體(ti)的正確給(gei)藥途徑，給(gei)藥時(shi)間(jian)點，給(gei)藥頻率和給(gei)藥部位，可(ke)以清除特定器官(guan)或組織中(zhong)的巨噬(shi)細(xi)胞(bao)。因此，氯(lv)膦酸(suan)鹽(yan)脂(zhi)質體(ti)是研究巨噬(shi)細(xi)胞(bao)功能的極好(hao)工具[2]。
Q2.Clodronate Liposomes（氯(lv)膦酸二鈉脂(zhi)質體）和Clodronate（氯(lv)膦酸二鈉）的半衰期是(shi)多少？
A2：死亡巨噬細胞釋放的氯膦酸(suan)鹽(yan)的半衰期（t1 / 2）為(wei)數(shu)分(fen)鐘[3]，因(yin)為(wei)游離氯膦酸(suan)鹽(yan)通過腎臟(zang)系統迅速(su)從循(xun)環中(zhong)被清除。 由于難以通過細胞膜，游離氯膦酸(suan)鹽(yan)分(fen)子不易進(jin)入細胞，包(bao)括脂質體(ti)磷脂雙分(fen)子層。 然而，如果它們(men)留在周(zhou)圍的介質中(zhong)，它們(men)可能會慢(man)慢(man)積聚到細胞中(zhong)[4]。
氯膦酸(suan)鹽(yan)(yan)脂質體(ti)的(de)(de)(de)半(ban)衰(shuai)期很難確定(ding)(ding)。 脂質體(ti)難以從血液(ye)中分離，并且它們在(zai)動(dong)物(wu)(wu)中的(de)(de)(de)分布不均勻。 此外，氯膦酸(suan)鹽(yan)(yan)脂質體(ti)的(de)(de)(de)半(ban)衰(shuai)期取決于(yu)巨噬細胞攝取和消(xiao)化(hua)所需的(de)(de)(de)時間，這由許多因素決定(ding)(ding)，例如(ru)：動(dong)物(wu)(wu)疾(ji)病模(mo)型的(de)(de)(de)免疫(yi)全(quan)能性，給藥途徑，給藥劑量。
Q3.實驗清除巨噬細胞不(bu)成功，可能(neng)的原因(yin)有哪些(xie)？
A3：氯(lv)膦酸鹽脂質(zhi)體活性的失敗可能是由于各種原因：
1）有效期已過：超過有效期后無法確保活性;
2）在(zai)極端(duan)溫度(du)下儲(chu)存：氯膦(lin)酸(suan)鹽脂質(zhi)體應(ying)儲(chu)存在(zai)4到8攝(she)氏(shi)度(du)之間。冷(leng)凍(dong)脂質(zhi)體或溫度(du)高(gao)于30攝(she)氏(shi)度(du)會影(ying)響膜(mo)的穩定(ding)性并降低氯膦(lin)酸(suan)鹽脂質(zhi)體活性;
3）脂質(zhi)體懸浮液的(de)稀釋：這(zhe)會影(ying)響懸浮液中(zhong)的(de)滲透壓，這(zhe)可能導致脂質(zhi)體膜的(de)不(bu)穩定;
4）給藥方案不合理：給藥方案應仔細選擇并考慮多種因素，例如：
a.打算消耗的巨噬細胞的類型（例如庫普弗細胞，小膠質細胞，肺泡巨噬細胞，破骨細胞）。例如，可以通過氣管內給藥靶向肺泡巨噬細胞，而內皮/上皮屏障另一側的間質巨噬細胞不會被該給藥途徑靶向;
b.是(shi)否打算短期(qi)或長期(qi)消耗它們;
c.動(dong)物的體重：較(jiao)大的動(dong)物需要更多(duo)的氯膦酸鹽脂質(zhi)體才能達(da)到清除(chu)閾(yu)值。
5）脂(zhi)質(zhi)(zhi)體懸浮液(ye)在(zai)使用前(qian)未重新懸浮：脂(zhi)質(zhi)(zhi)體在(zai)儲存期(qi)間傾(qing)向于沉淀，確保在(zai)使用前(qian)輕輕搖動重懸，以(yi)防止僅注射不含脂(zhi)質(zhi)(zhi)體的PBS溶(rong)液(ye);
6）注射時出錯：確保注射是否成功非常重要。例如，如果您在尾靜脈注射期間看到鼓包形成，則可能是您注射到皮膚組織了，沒有注射到靜脈里。當腹膜內注射時，確保將脂質體懸浮液注射到腹腔內（而不是在腸內）。為了驗證脂質體是否已到達您想要的位置，可以使用熒光Dil脂質體;
7）檢驗清(qing)(qing)除的(de)手(shou)段是(shi)否正確：需要選(xuan)擇正確的(de)標(biao)記來確定清(qing)(qing)除是(shi)否成(cheng)功。此外(wai)，您需要考慮到(dao)每種(zhong)給藥方(fang)案(an)和（動物(wu)）模型的(de)巨噬(shi)細胞的(de)消耗和再(zai)增(zeng)殖動力學(xue)不同。
Q4.實(shi)驗動(dong)物(wu)在注射(she)后立即死亡，可能(neng)的原因有(you)哪(na)些？
A4：這很可(ke)能是(shi)由(you)于(yu)注射了非均質的(de)沉淀(dian)脂質體(ti)。 沉淀(dian)的(de)脂質體(ti)可(ke)引(yin)起栓塞(sai)，從(cong)而部(bu)分或(huo)完全阻斷(duan)動脈或(huo)靜脈中的(de)血流(liu)。 由(you)于(yu)脂質體(ti)在(zai)儲存期間容易沉淀(dian)，因(yin)此請確保在(zai)使(shi)用前顛(dian)倒混勻。
另一個原(yuan)因可能(neng)是脂質體懸浮液的溫(wen)度。 脂質體應儲(chu)存(cun)在4到8攝氏度之間(jian)，但應平(ping)衡到室(shi)溫(wen)后給藥。
注意：如果注射需要較長，脂質體可能在注射器中沉淀，當使用相同的注射器注射多只動物時，這可能導致差異劑量。
Q5.實驗動物在注射后(hou)數小時或者數天死亡(wang)，可能的原因(yin)是什(shen)么(me)？
A5：這很可(ke)能(neng)是(shi)由注(zhu)(zhu)射前或注(zhu)(zhu)射過程中的(de)(de)微生物(wu)污染引起的(de)(de)。當注(zhu)(zhu)射氯膦酸鹽脂質體(ti)時(shi)，巨噬細(xi)胞的(de)(de)清除可(ke)使動物(wu)更容易受(shou)到感染，尤其是(shi)免疫(yi)缺陷動物(wu)。
Q6.如何存(cun)儲脂質體懸液？
A6：儲存在4-8oC（或(huo)39-47oF）之間。 脂質體(ti)懸浮液不(bu)應(ying)該(gai)冷(leng)凍(dong)，也不(bu)應(ying)暴露(lu)在極端高(gao)溫下。
Q7.氯膦酸二鈉脂(zhi)質體懸液的濃度是多少？
A7：平均而言，整個脂質體懸浮液的濃度為5mg氯膦酸鹽/ mL。 氯膦酸鹽以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂質體囊泡中。
Q8.脂質(zhi)體的粒(li)徑和電荷是多少？
A8：所有的脂質(zhi)體（即(ji)氯膦酸鹽(yan)，PBS和(he)熒光Dil脂質(zhi)體）都帶有輕微(wei)帶負電，因此不(bu)會聚集在一起。 懸浮液中的脂質(zhi)體沒有按(an)特定的粒徑截留，脂質(zhi)體的大小不(bu)等（最大3微(wei)米(mi)）。 平均而言，脂質(zhi)體的大小為1.7微(wei)米(mi)。
Q9.溶(rong)解脂質體的緩沖液(ye)是什么？
A9：所(suo)有的脂質(zhi)體(ti)制劑（即氯(lv)膦酸(suan)(suan)鹽脂質(zhi)體(ti)，對照脂質(zhi)體(ti)和熒光(guang)Dil脂質(zhi)體(ti)）懸浮(fu)于無菌磷酸(suan)(suan)鹽緩沖鹽溶(rong)液（PBS）：10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4，>140mM NaCl中。
Q10.如何(he)檢測熒(ying)光Dil脂質體(ti)？
A10：用熒光(guang)染料(liao)DiI標記(ji)(ji)的(de)脂質體，作為對(dui)照，可(ke)用于研究脂質體是否已通過所選的(de)給藥方(fang)案達到靶向(xiang)的(de)巨噬細(xi)胞群。 熒光(guang)標記(ji)(ji)將顯示脂質體在組織內的(de)分(fen)布模(mo)式及其對(dui)巨噬細(xi)胞的(de)攝取(qu)。 Dil標記(ji)(ji)的(de)脂質體可(ke)以通過流(liu)式細(xi)胞術和(he)熒光(guang)顯微鏡(jing)檢測(ce)。 DiI分(fen)子的(de)激發(fa)和(he)發(fa)射分(fen)別(bie)為549和(he)565nm。
Q11.發表研究成果時，如何引用(yong)LIPOSOMA的產品？
A11：當用(yong)LIPOSOMA的脂質(zhi)體(ti)制劑用(yong)于實(shi)驗并打(da)算發(fa)表研究成果時，引(yin)用(yong)格式(shi)：“LIPOSOMA，the Netherlands（clodronateliposomes.com）”。
參考文獻：
1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.
2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.
3. Fleisch, H. (2000). Bisphosphonates in bone disease: from the laboratory to the patient. Elsevier.
4.Claassen, I., Van Rooijen, N., & Claassen, E. (1990). A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogeneous cell populations in vitro, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. Journal of immunological methods, 134(2), 153-161.
