巨(ju)(ju)噬細胞無論是在(zai)維持機體(ti)的(de)生(sheng)理(li)(li)穩態(tai)還(huan)是斡旋(xuan)組織的(de)病理(li)(li)炎性(xing)(xing)，都發(fa)揮重要的(de)作(zuo)用。此(ci)外(wai)，巨(ju)(ju)噬細胞也促進多種疾病的(de)病理(li)(li)生(sheng)理(li)(li)學(xue)，如(ru)包括癌癥和(he)各種炎癥性(xing)(xing)紊亂。巨(ju)(ju)噬細胞功(gong)能的(de)多樣性(xing)(xing)也正如(ru)它起源的(de)復雜性(xing)(xing)（當然(ran)爭議性(xing)(xing)更大），形態(tai)的(de)異質(zhi)性(xing)(xing)，表(biao)型的(de)可塑性(xing)(xing)。因此(ci)，巨(ju)(ju)噬細胞作(zuo)為(wei)一種具有可塑性(xing)(xing)，多能性(xing)(xing)和(he)異質(zhi)性(xing)(xing)的(de)細胞群體(ti),在(zai)體(ti)內(nei)和(he)體(ti)外(wai)不同的(de)微環境影響下,表(biao)現出獨特(te)的(de)表(biao)型和(he)功(gong)能，體(ti)現的(de)是一個在(zai)時(shi)間(jian)和(he)空間(jian)上受一系列(lie)機體(ti)免疫(yi)學(xue)網(wang)絡所調控的(de)復雜動態(tai)連續性(xing)(xing)生(sheng)物學(xue)過程。
為了更(geng)好的(de)研究(jiu)巨噬(shi)細胞功(gong)能，設計(ji)研究(jiu)實驗時(shi)，要(yao)在時(shi)間上（疾病的(de)發生和(he)發展(zhan)）和(he)空間上（病灶的(de)原位，組織(zhi)，器官）考(kao)慮到(dao)巨噬(shi)細胞的(de)起(qi)源(yuan)，更(geng)新，補充(chong)，形態，表(biao)型和(he)功(gong)能的(de)連續性(xing)(xing)，動態性(xing)(xing)和(he)網絡(luo)性(xing)(xing)。
Q1.為什么(me)Clodronate Liposomes（氯膦酸二(er)鈉脂(zhi)質體）是研究(jiu)巨噬細胞(bao)功能的(de)利(li)器？
A1：巨噬細胞在免疫系統中(zhong)發揮重要作用。它們主(zhu)要通(tong)過(guo)可(ke)溶性分子(zi)，如細胞因(yin)子(zi)和(he)趨(qu)化(hua)因(yin)子(zi)的(de)介導來調節許多非吞(tun)噬細胞的(de)功(gong)能(neng)。巨噬細胞還(huan)通(tong)過(guo)攝取和(he)消化(hua)微生物或非自身(shen)顆粒和(he)大分子(zi)參與身(shen)體(ti)的(de)“穩態”。內吞(tun)物的(de)消化(hua)是由其(qi)溶酶(mei)體(ti)酶(mei)介導的(de)。
脂(zhi)質(zhi)體是(shi)人(ren)工(gong)制備的(de)脂(zhi)質(zhi)囊泡，由夾帶水(shui)(shui)性(xing)隔室的(de)同心磷(lin)脂(zhi)雙層組成(cheng)。它們可用于包封(feng)溶解(jie)在水(shui)(shui)溶液(ye)中(zhong)的(de)強(qiang)親(qin)水(shui)(shui)性(xing)分子，例(li)如氯膦酸(suan)鹽，一種為人(ren)類應(ying)用開發(fa)的(de)無毒二(er)膦酸(suan)鹽。
注射(she)后，氯膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽脂(zhi)質(zhi)體起到特洛伊木馬(ma)的(de)作用(yong)。巨噬(shi)細胞攝取氯膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽脂(zhi)質(zhi)體并消化脂(zhi)質(zhi)體膜。氯膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽不會(hui)被消化，并會(hui)留在(zai)巨噬(shi)細胞內。更多(duo)氯膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽將在(zai)巨噬(shi)細胞中(zhong)積聚，因為它會(hui)攝取和消化更多(duo)的(de)氯膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽脂(zhi)質(zhi)體。當氯膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽在(zai)細胞內聚集到一定的(de)濃(nong)度后，氯膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽會(hui)通過啟動(dong)其程序(xu)性(xing)細胞死亡(wang)即細胞凋亡(wang)來清除巨噬(shi)細胞[1]。
通過選擇(ze)氯(lv)(lv)膦酸(suan)(suan)鹽(yan)脂質體的(de)正確給藥(yao)(yao)途徑，給藥(yao)(yao)時間點(dian)，給藥(yao)(yao)頻率(lv)和給藥(yao)(yao)部位，可以清(qing)除(chu)特定器官或組織中的(de)巨噬細胞。因此，氯(lv)(lv)膦酸(suan)(suan)鹽(yan)脂質體是(shi)研究巨噬細胞功(gong)能的(de)極好工(gong)具[2]。
Q2.Clodronate Liposomes（氯膦(lin)酸二(er)鈉脂質體）和Clodronate（氯膦(lin)酸二(er)鈉）的半衰期是多少？
A2：死(si)亡巨噬(shi)細(xi)(xi)胞釋放的氯(lv)膦(lin)酸(suan)鹽(yan)的半衰(shuai)期（t1 / 2）為數分(fen)鐘[3]，因為游(you)離(li)(li)氯(lv)膦(lin)酸(suan)鹽(yan)通過(guo)腎臟系(xi)統迅(xun)速從(cong)循環中被(bei)清(qing)除。 由于(yu)難以通過(guo)細(xi)(xi)胞膜，游(you)離(li)(li)氯(lv)膦(lin)酸(suan)鹽(yan)分(fen)子不易進入(ru)細(xi)(xi)胞，包括脂質(zhi)體磷脂雙分(fen)子層。 然而，如(ru)果它(ta)們留在周圍的介(jie)質(zhi)中，它(ta)們可能會慢慢積(ji)聚到細(xi)(xi)胞中[4]。
氯(lv)膦(lin)酸鹽(yan)脂質體(ti)的(de)半(ban)衰期(qi)很難確(que)定。 脂質體(ti)難以(yi)從血液(ye)中分(fen)離，并且它們在(zai)動(dong)物中的(de)分(fen)布不均勻。 此外，氯(lv)膦(lin)酸鹽(yan)脂質體(ti)的(de)半(ban)衰期(qi)取決(jue)于(yu)巨(ju)噬(shi)細(xi)胞攝取和(he)消化所(suo)需的(de)時間，這由許多因素決(jue)定，例如：動(dong)物疾病模(mo)型(xing)的(de)免(mian)疫全能性，給藥途徑，給藥劑量。
Q3.實(shi)驗清除(chu)巨噬(shi)細胞不成功，可能的原因有哪些？
A3：氯膦酸鹽(yan)脂質體活性的失敗可(ke)能(neng)是由于各(ge)種(zhong)原因：
1）有效期已過：超過有效期后無法確保活性;
2）在極(ji)端溫度(du)下儲存(cun)(cun)：氯膦酸鹽脂質體應儲存(cun)(cun)在4到(dao)8攝氏度(du)之間。冷(leng)凍脂質體或溫度(du)高于30攝氏度(du)會影響膜的穩(wen)定(ding)性(xing)并降低(di)氯膦酸鹽脂質體活性(xing);
3）脂質(zhi)體(ti)懸浮液的(de)稀(xi)釋：這會(hui)影響懸浮液中的(de)滲透壓(ya)，這可能(neng)導致脂質(zhi)體(ti)膜的(de)不穩定;
4）給藥方案不合理：給藥方案應仔細選擇并考慮多種因素，例如：
a.打算消耗的巨噬細胞的類型（例如庫普弗細胞，小膠質細胞，肺泡巨噬細胞，破骨細胞）。例如，可以通過氣管內給藥靶向肺泡巨噬細胞，而內皮/上皮屏障另一側的間質巨噬細胞不會被該給藥途徑靶向;
b.是(shi)否打算短期(qi)或(huo)長期(qi)消耗它們(men);
c.動物的體重(zhong)：較大(da)的動物需要更多(duo)的氯膦酸鹽脂質體才(cai)能達(da)到清除閾值。
5）脂質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)懸浮液在使用前(qian)未重新懸浮：脂質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)在儲存期間傾向(xiang)于沉淀(dian)，確保在使用前(qian)輕輕搖動(dong)重懸，以防止僅注射不含(han)脂質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的PBS溶液;
6）注射時出錯：確保注射是否成功非常重要。例如，如果您在尾靜脈注射期間看到鼓包形成，則可能是您注射到皮膚組織了，沒有注射到靜脈里。當腹膜內注射時，確保將脂質體懸浮液注射到腹腔內（而不是在腸內）。為了驗證脂質體是否已到達您想要的位置，可以使用熒光Dil脂質體;
7）檢驗清(qing)除(chu)的手段是否正確：需要選擇正確的標記(ji)來確定清(qing)除(chu)是否成(cheng)功。此外(wai)，您需要考慮到每種給藥方案和（動(dong)物(wu)）模型的巨噬細胞(bao)的消耗和再增殖動(dong)力學不同。
Q4.實驗動物在(zai)注射后立即死(si)亡，可(ke)能的(de)原因有哪(na)些？
A4：這很可能是(shi)由(you)于注(zhu)射了非(fei)均(jun)質(zhi)的(de)(de)(de)沉(chen)淀脂(zhi)質(zhi)體(ti)。 沉(chen)淀的(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)體(ti)可引起栓(shuan)塞，從而部分(fen)或(huo)完全(quan)阻斷動脈或(huo)靜(jing)脈中的(de)(de)(de)血(xue)流(liu)。 由(you)于脂(zhi)質(zhi)體(ti)在(zai)儲存期間容易沉(chen)淀，因此請確保在(zai)使(shi)用前顛倒混(hun)勻。
另一個原因可能是脂質體(ti)(ti)懸浮(fu)液的溫度(du)。 脂質體(ti)(ti)應儲(chu)存(cun)在4到(dao)8攝(she)氏度(du)之間，但應平(ping)衡到(dao)室溫后給藥。
注意：如果注射需要較長，脂質體可能在注射器中沉淀，當使用相同的注射器注射多只動物時，這可能導致差異劑量。
Q5.實驗(yan)動物(wu)在注射后(hou)數(shu)小時或(huo)者(zhe)數(shu)天死亡，可(ke)能的原因是什么(me)？
A5：這很可能是由注(zhu)射前或注(zhu)射過(guo)程中(zhong)的(de)微(wei)生物(wu)污染(ran)引起的(de)。當注(zhu)射氯膦酸鹽脂質體(ti)時，巨噬(shi)細胞的(de)清除可使動(dong)物(wu)更容易受到感染(ran)，尤其是免疫缺陷動(dong)物(wu)。
Q6.如何存(cun)儲脂質(zhi)體懸液？
A6：儲(chu)存在(zai)4-8oC（或(huo)39-47oF）之(zhi)間。 脂質體(ti)懸(xuan)浮液(ye)不(bu)應該冷凍，也不(bu)應暴(bao)露在(zai)極端高溫(wen)下。
Q7.氯膦(lin)酸二鈉脂質體(ti)懸(xuan)液的濃度是(shi)多少？
A7：平均而言，整個脂質體懸浮液的濃度為5mg氯膦酸鹽/ mL。 氯膦酸鹽以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂質體囊泡中。
Q8.脂質體的粒徑和電荷是多(duo)少？
A8：所(suo)有(you)(you)的(de)(de)脂質(zhi)體（即氯膦酸(suan)鹽，PBS和熒光Dil脂質(zhi)體）都帶有(you)(you)輕微(wei)帶負電(dian)，因(yin)此(ci)不會聚集在一起。 懸浮(fu)液中的(de)(de)脂質(zhi)體沒有(you)(you)按(an)特定的(de)(de)粒徑截(jie)留，脂質(zhi)體的(de)(de)大(da)小不等（最大(da)3微(wei)米）。 平(ping)均而言，脂質(zhi)體的(de)(de)大(da)小為1.7微(wei)米。
Q9.溶解(jie)脂質體的緩沖液是什么(me)？
A9：所有的脂(zhi)質體制(zhi)劑（即氯(lv)膦酸(suan)鹽脂(zhi)質體，對照脂(zhi)質體和熒光Dil脂(zhi)質體）懸(xuan)浮于(yu)無菌磷酸(suan)鹽緩沖鹽溶液（PBS）：10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4，>140mM NaCl中(zhong)。
Q10.如何檢測熒光Dil脂質體？
A10：用熒(ying)(ying)光(guang)染料DiI標記(ji)的(de)脂質(zhi)體(ti)，作為(wei)對照，可(ke)(ke)用于(yu)研究脂質(zhi)體(ti)是否已通過(guo)所選的(de)給藥方(fang)案達到(dao)靶向的(de)巨噬細胞群(qun)。 熒(ying)(ying)光(guang)標記(ji)將顯示(shi)脂質(zhi)體(ti)在組織內的(de)分(fen)布模式及其對巨噬細胞的(de)攝(she)取。 Dil標記(ji)的(de)脂質(zhi)體(ti)可(ke)(ke)以(yi)通過(guo)流式細胞術(shu)和熒(ying)(ying)光(guang)顯微(wei)鏡檢(jian)測。 DiI分(fen)子的(de)激發(fa)和發(fa)射分(fen)別(bie)為(wei)549和565nm。
Q11.發(fa)表研究(jiu)成(cheng)果時，如何引用LIPOSOMA的產品？
A11：當用(yong)LIPOSOMA的脂質(zhi)體制(zhi)劑用(yong)于實驗并(bing)打算發表研(yan)究成果時，引用(yong)格式：“LIPOSOMA，the Netherlands（clodronateliposomes.com）”。
參考文獻：
1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.
2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.
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