巨(ju)噬(shi)(shi)(shi)細(xi)(xi)(xi)胞無論是在維(wei)持(chi)機體的(de)生(sheng)(sheng)理(li)(li)穩態(tai)(tai)還是斡旋組織(zhi)的(de)病理(li)(li)炎性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)，都發揮(hui)重(zhong)要的(de)作用。此外，巨(ju)噬(shi)(shi)(shi)細(xi)(xi)(xi)胞也促進多種(zhong)疾病的(de)病理(li)(li)生(sheng)(sheng)理(li)(li)學，如包括癌癥和(he)(he)(he)(he)各種(zhong)炎癥性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)紊亂。巨(ju)噬(shi)(shi)(shi)細(xi)(xi)(xi)胞功能(neng)的(de)多樣性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)也正如它起(qi)源(yuan)的(de)復雜性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)（當(dang)然爭(zheng)議(yi)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)更大），形(xing)態(tai)(tai)的(de)異(yi)質性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)，表(biao)(biao)型(xing)的(de)可(ke)塑性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)。因此，巨(ju)噬(shi)(shi)(shi)細(xi)(xi)(xi)胞作為(wei)一種(zhong)具(ju)有可(ke)塑性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)，多能(neng)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)(he)(he)(he)異(yi)質性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)細(xi)(xi)(xi)胞群體,在體內和(he)(he)(he)(he)體外不同的(de)微環境影響下,表(biao)(biao)現出獨特(te)的(de)表(biao)(biao)型(xing)和(he)(he)(he)(he)功能(neng)，體現的(de)是一個在時間(jian)(jian)和(he)(he)(he)(he)空間(jian)(jian)上(shang)受一系列機體免(mian)疫學網(wang)絡所調控(kong)的(de)復雜動態(tai)(tai)連續(xu)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)生(sheng)(sheng)物(wu)學過程。
為(wei)了更(geng)好的(de)(de)(de)(de)研究巨(ju)噬細胞功能，設計研究實(shi)驗時，要在時間(jian)上（疾病的(de)(de)(de)(de)發(fa)生和(he)發(fa)展）和(he)空間(jian)上（病灶的(de)(de)(de)(de)原位(wei)，組織，器(qi)官）考慮到巨(ju)噬細胞的(de)(de)(de)(de)起源，更(geng)新(xin)，補充，形態，表型和(he)功能的(de)(de)(de)(de)連續(xu)性(xing)，動態性(xing)和(he)網絡性(xing)。
Q1.為什么Clodronate Liposomes（氯膦酸二(er)鈉脂質體）是研究(jiu)巨噬細(xi)胞功(gong)能的利器？
A1：巨(ju)噬細(xi)(xi)胞在免疫系統中(zhong)發揮重要作(zuo)用(yong)。它(ta)們主要通(tong)過可溶性分子(zi)(zi)，如細(xi)(xi)胞因子(zi)(zi)和趨化因子(zi)(zi)的(de)(de)介導來調(diao)節許(xu)多非吞噬細(xi)(xi)胞的(de)(de)功能。巨(ju)噬細(xi)(xi)胞還通(tong)過攝取和消化微生物或非自身(shen)顆粒和大分子(zi)(zi)參與(yu)身(shen)體的(de)(de)“穩(wen)態”。內吞物的(de)(de)消化是由其溶酶體酶介導的(de)(de)。
脂質體是(shi)人工制備的脂質囊泡，由夾帶水(shui)性(xing)隔室的同心(xin)磷脂雙層組成(cheng)。它們可用于包封溶解在水(shui)溶液中的強親水(shui)性(xing)分子，例如氯膦(lin)酸(suan)鹽(yan)，一種為人類應用開(kai)發(fa)的無(wu)毒(du)二膦(lin)酸(suan)鹽(yan)。
注射后(hou)，氯(lv)(lv)(lv)膦酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)脂質(zhi)體(ti)起(qi)到特洛伊木(mu)馬的(de)作用。巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)攝取氯(lv)(lv)(lv)膦酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)脂質(zhi)體(ti)并(bing)(bing)消化(hua)脂質(zhi)體(ti)膜(mo)。氯(lv)(lv)(lv)膦酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)不會被消化(hua)，并(bing)(bing)會留在(zai)巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)內(nei)。更(geng)多氯(lv)(lv)(lv)膦酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)將在(zai)巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)中積聚，因為(wei)它會攝取和消化(hua)更(geng)多的(de)氯(lv)(lv)(lv)膦酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)脂質(zhi)體(ti)。當氯(lv)(lv)(lv)膦酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)在(zai)細(xi)(xi)胞(bao)內(nei)聚集(ji)到一定的(de)濃(nong)度后(hou)，氯(lv)(lv)(lv)膦酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)會通過(guo)啟動(dong)其程序性細(xi)(xi)胞(bao)死亡即細(xi)(xi)胞(bao)凋亡來清除巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)[1]。
通過選擇氯膦酸鹽脂質(zhi)(zhi)體(ti)的正確給藥途徑，給藥時間(jian)點，給藥頻率和給藥部位，可以清除特(te)定(ding)器官或組織中的巨噬(shi)細胞。因此(ci)，氯膦酸鹽脂質(zhi)(zhi)體(ti)是研(yan)究巨噬(shi)細胞功能的極好工(gong)具[2]。
Q2.Clodronate Liposomes（氯(lv)膦(lin)酸(suan)二鈉脂(zhi)質體）和Clodronate（氯(lv)膦(lin)酸(suan)二鈉）的半衰(shuai)期是多少(shao)？
A2：死亡巨噬細胞釋(shi)放的(de)氯膦(lin)(lin)酸(suan)鹽的(de)半衰期（t1 / 2）為數分鐘(zhong)[3]，因(yin)為游離(li)氯膦(lin)(lin)酸(suan)鹽通過(guo)腎臟系(xi)統(tong)迅(xun)速從循環中(zhong)被清除。 由于難(nan)以(yi)通過(guo)細胞膜，游離(li)氯膦(lin)(lin)酸(suan)鹽分子不(bu)易進(jin)入細胞，包括脂(zhi)質體磷脂(zhi)雙(shuang)分子層(ceng)。 然(ran)而，如果它(ta)(ta)們留在周圍的(de)介質中(zhong)，它(ta)(ta)們可能會慢慢積聚到細胞中(zhong)[4]。
氯(lv)膦酸鹽脂質(zhi)體(ti)的(de)(de)半衰(shuai)(shuai)期很(hen)難(nan)(nan)確定(ding)。 脂質(zhi)體(ti)難(nan)(nan)以從血液中(zhong)分離，并(bing)且它們在動(dong)物(wu)中(zhong)的(de)(de)分布不(bu)均勻。 此外，氯(lv)膦酸鹽脂質(zhi)體(ti)的(de)(de)半衰(shuai)(shuai)期取決于(yu)巨噬細(xi)胞攝(she)取和消化(hua)所需的(de)(de)時間，這由(you)許多(duo)因素決定(ding)，例(li)如：動(dong)物(wu)疾病(bing)模(mo)型的(de)(de)免(mian)疫全(quan)能性，給(gei)藥途徑，給(gei)藥劑(ji)量(liang)。
Q3.實驗清除巨(ju)噬(shi)細胞不成功，可能的原因有(you)哪些？
A3：氯膦(lin)酸(suan)鹽脂質體活性的失敗可能是(shi)由于各種原因：
1）有效期已過：超過有效期后無法確保活性;
2）在極端溫度下(xia)儲存：氯膦酸(suan)鹽(yan)(yan)脂(zhi)質體(ti)應儲存在4到8攝氏度之間。冷凍(dong)脂(zhi)質體(ti)或溫度高于30攝氏度會影響膜的穩定性(xing)并降低(di)氯膦酸(suan)鹽(yan)(yan)脂(zhi)質體(ti)活性(xing);
3）脂質體懸(xuan)浮液的稀釋：這會影響懸(xuan)浮液中的滲透壓，這可能導致脂質體膜(mo)的不穩定;
4）給藥方案不合理：給藥方案應仔細選擇并考慮多種因素，例如：
a.打算消耗的巨噬細胞的類型（例如庫普弗細胞，小膠質細胞，肺泡巨噬細胞，破骨細胞）。例如，可以通過氣管內給藥靶向肺泡巨噬細胞，而內皮/上皮屏障另一側的間質巨噬細胞不會被該給藥途徑靶向;
b.是否打算短期(qi)或長期(qi)消耗(hao)它們;
c.動物的(de)體重(zhong)：較大(da)的(de)動物需(xu)要更多(duo)的(de)氯膦酸鹽脂(zhi)質體才能(neng)達到(dao)清除閾值(zhi)。
5）脂(zhi)質體(ti)懸浮(fu)液(ye)在(zai)使用前未(wei)重新懸浮(fu)：脂(zhi)質體(ti)在(zai)儲存期間(jian)傾向于沉淀(dian)，確保在(zai)使用前輕(qing)輕(qing)搖動重懸，以防止僅注射不含脂(zhi)質體(ti)的PBS溶液(ye);
6）注射時出錯：確保注射是否成功非常重要。例如，如果您在尾靜脈注射期間看到鼓包形成，則可能是您注射到皮膚組織了，沒有注射到靜脈里。當腹膜內注射時，確保將脂質體懸浮液注射到腹腔內（而不是在腸內）。為了驗證脂質體是否已到達您想要的位置，可以使用熒光Dil脂質體;
7）檢(jian)驗清除的(de)手段是(shi)(shi)否(fou)正確：需(xu)要選擇正確的(de)標(biao)記(ji)來確定(ding)清除是(shi)(shi)否(fou)成(cheng)功。此外，您需(xu)要考(kao)慮到每(mei)種給藥方(fang)案和（動(dong)物）模型的(de)巨噬(shi)細胞的(de)消(xiao)耗和再(zai)增殖(zhi)動(dong)力學不同。
Q4.實驗動物在注射后立即死亡，可能的原因有哪些？
A4：這很可能是由于注射了非(fei)均質的沉(chen)淀脂(zhi)質體。 沉(chen)淀的脂(zhi)質體可引起栓塞，從而部(bu)分(fen)或完全阻斷動脈或靜脈中的血流(liu)。 由于脂(zhi)質體在儲存期間容易沉(chen)淀，因(yin)此(ci)請確保在使用前(qian)顛倒混(hun)勻。
另一個原因可(ke)能(neng)是脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體懸(xuan)浮液的溫度。 脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體應儲存在4到8攝(she)氏(shi)度之(zhi)間，但應平衡到室溫后給藥。
注意：如果注射需要較長，脂質體可能在注射器中沉淀，當使用相同的注射器注射多只動物時，這可能導致差異劑量。
Q5.實驗動物在注(zhu)射后數小時(shi)或者數天死(si)亡，可能的原因是什么？
A5：這很可能是由注(zhu)(zhu)射(she)前或注(zhu)(zhu)射(she)過程中(zhong)的微生物污染(ran)引(yin)起的。當注(zhu)(zhu)射(she)氯膦酸鹽脂質(zhi)體時，巨噬細胞的清(qing)除可使動物更(geng)容(rong)易受到感染(ran)，尤其是免疫缺陷(xian)動物。
Q6.如何存儲脂(zhi)質(zhi)體懸液？
A6：儲存在4-8oC（或(huo)39-47oF）之間。 脂質體懸(xuan)浮液不(bu)應(ying)該冷凍，也不(bu)應(ying)暴(bao)露在極端高溫(wen)下。
Q7.氯膦酸(suan)二鈉(na)脂質體(ti)懸液的濃度是(shi)多少(shao)？
A7：平均而言，整個脂質體懸浮液的濃度為5mg氯膦酸鹽/ mL。 氯膦酸鹽以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂質體囊泡中。
Q8.脂(zhi)質體的粒徑(jing)和電荷是(shi)多(duo)少(shao)？
A8：所有(you)的(de)(de)脂質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)（即氯膦酸鹽，PBS和(he)熒光Dil脂質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)）都帶有(you)輕微帶負電，因此(ci)不會(hui)聚集(ji)在一起。 懸浮液中的(de)(de)脂質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)沒(mei)有(you)按(an)特定的(de)(de)粒徑截留，脂質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)的(de)(de)大(da)小不等（最大(da)3微米(mi)）。 平(ping)均而言，脂質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)的(de)(de)大(da)小為1.7微米(mi)。
Q9.溶(rong)解脂質體(ti)的(de)緩沖(chong)液是什么(me)？
A9：所有的脂(zhi)質(zhi)(zhi)體制劑（即氯膦酸鹽(yan)脂(zhi)質(zhi)(zhi)體，對照脂(zhi)質(zhi)(zhi)體和熒(ying)光(guang)Dil脂(zhi)質(zhi)(zhi)體）懸浮于(yu)無菌磷酸鹽(yan)緩(huan)沖鹽(yan)溶液（PBS）：10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4，>140mM NaCl中。
Q10.如何(he)檢測(ce)熒(ying)光(guang)Dil脂質體(ti)？
A10：用熒(ying)光染料DiI標記的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)，作為對照，可用于(yu)研究脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)是否已通過(guo)所(suo)選的(de)(de)(de)給藥方案達到靶向的(de)(de)(de)巨噬(shi)(shi)細胞(bao)群(qun)。 熒(ying)光標記將(jiang)顯(xian)示脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)在組織內的(de)(de)(de)分(fen)布(bu)模(mo)式及其(qi)對巨噬(shi)(shi)細胞(bao)的(de)(de)(de)攝(she)取。 Dil標記的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)可以通過(guo)流(liu)式細胞(bao)術(shu)和(he)熒(ying)光顯(xian)微鏡(jing)檢測(ce)。 DiI分(fen)子的(de)(de)(de)激發和(he)發射分(fen)別為549和(he)565nm。
Q11.發表研究(jiu)成果時，如何引用LIPOSOMA的產品？
A11：當用(yong)LIPOSOMA的脂質(zhi)體制劑(ji)用(yong)于實驗(yan)并打算發表研究(jiu)成果時，引用(yong)格式(shi)：“LIPOSOMA，the Netherlands（clodronateliposomes.com）”。
參考文獻：
1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.
2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.
3. Fleisch, H. (2000). Bisphosphonates in bone disease: from the laboratory to the patient. Elsevier.
4.Claassen, I., Van Rooijen, N., & Claassen, E. (1990). A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogeneous cell populations in vitro, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. Journal of immunological methods, 134(2), 153-161.
