巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)無論(lun)是(shi)在(zai)維持機(ji)體(ti)的生理(li)穩態(tai)還是(shi)斡旋(xuan)組(zu)織的病理(li)炎性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)，都(dou)發揮重要的作用。此外，巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)也促進多種疾病的病理(li)生理(li)學(xue)(xue)(xue)，如(ru)包括癌癥和各種炎癥性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)紊亂。巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)功(gong)能的多樣性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)也正如(ru)它(ta)起源的復雜性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)（當(dang)然爭(zheng)議(yi)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)更大(da)），形態(tai)的異質性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)，表(biao)型的可(ke)塑性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)。因此，巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)作為一種具有可(ke)塑性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)，多能性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)和異質性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)的細(xi)(xi)胞(bao)(bao)群(qun)體(ti),在(zai)體(ti)內和體(ti)外不同的微環境影(ying)響下(xia),表(biao)現出獨特的表(biao)型和功(gong)能，體(ti)現的是(shi)一個(ge)在(zai)時間(jian)和空間(jian)上(shang)受一系列機(ji)體(ti)免疫學(xue)(xue)(xue)網(wang)絡所調控的復雜動態(tai)連續(xu)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)生物學(xue)(xue)(xue)過(guo)程。
為了更好的(de)研究巨噬(shi)細胞(bao)(bao)功能，設(she)計研究實驗(yan)時，要在時間(jian)上（疾(ji)病的(de)發生(sheng)和發展）和空(kong)間(jian)上（病灶的(de)原位，組織，器官）考慮到巨噬(shi)細胞(bao)(bao)的(de)起源(yuan)，更新，補充，形態，表型和功能的(de)連(lian)續性(xing)，動態性(xing)和網絡性(xing)。
Q1.為什么(me)Clodronate Liposomes（氯(lv)膦酸二鈉脂質體）是研究巨噬細胞功能的利(li)器(qi)？
A1：巨噬(shi)細胞在免疫系統中發揮重(zhong)要作用。它(ta)們主要通過(guo)可(ke)溶性分子(zi)(zi)，如細胞因(yin)子(zi)(zi)和(he)趨化因(yin)子(zi)(zi)的(de)(de)介導來調(diao)節許(xu)多非吞(tun)噬(shi)細胞的(de)(de)功能(neng)。巨噬(shi)細胞還通過(guo)攝取(qu)和(he)消化微(wei)生物(wu)或非自(zi)身(shen)顆(ke)粒和(he)大分子(zi)(zi)參與(yu)身(shen)體的(de)(de)“穩態”。內吞(tun)物(wu)的(de)(de)消化是由其溶酶(mei)體酶(mei)介導的(de)(de)。
脂質體是人工制備的脂質囊泡，由夾帶(dai)水性隔室(shi)的同心磷脂雙層組(zu)成(cheng)。它們可用于包封(feng)溶解在水溶液中的強(qiang)親(qin)水性分子，例如氯(lv)膦酸鹽，一種為人類應用開發的無毒二(er)膦酸鹽。
注(zhu)射后，氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)脂質(zhi)體起到特洛(luo)伊木馬的作用。巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)攝取(qu)氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)脂質(zhi)體并(bing)消(xiao)(xiao)化脂質(zhi)體膜。氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)不會(hui)被(bei)消(xiao)(xiao)化，并(bing)會(hui)留在巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)內。更多氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)將(jiang)在巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中積聚，因(yin)為它(ta)會(hui)攝取(qu)和消(xiao)(xiao)化更多的氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)脂質(zhi)體。當氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)在細(xi)胞(bao)(bao)(bao)內聚集到一定的濃度后，氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)(yan)會(hui)通過(guo)啟動其程序性細(xi)胞(bao)(bao)(bao)死亡即細(xi)胞(bao)(bao)(bao)凋亡來清除巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)[1]。
通過選(xuan)擇氯膦(lin)(lin)酸鹽(yan)脂質體的正確給(gei)藥途(tu)徑，給(gei)藥時間點(dian)，給(gei)藥頻率和(he)給(gei)藥部位，可(ke)以清除特定器官或組織中的巨噬細胞(bao)。因此，氯膦(lin)(lin)酸鹽(yan)脂質體是(shi)研究巨噬細胞(bao)功能的極好工(gong)具[2]。
Q2.Clodronate Liposomes（氯(lv)膦酸二(er)鈉(na)脂質體）和Clodronate（氯(lv)膦酸二(er)鈉(na)）的半衰期是多少？
A2：死(si)亡巨(ju)噬細(xi)胞(bao)釋放的氯(lv)膦酸鹽的半衰期(qi)（t1 / 2）為數分(fen)鐘[3]，因為游(you)離氯(lv)膦酸鹽通過腎臟系統(tong)迅(xun)速從循環中被清除(chu)。 由于(yu)難以通過細(xi)胞(bao)膜，游(you)離氯(lv)膦酸鹽分(fen)子(zi)不易進入細(xi)胞(bao)，包括脂(zhi)質(zhi)體磷(lin)脂(zhi)雙分(fen)子(zi)層。 然而，如(ru)果它們(men)(men)留在周圍的介質(zhi)中，它們(men)(men)可能(neng)會慢慢積聚(ju)到細(xi)胞(bao)中[4]。
氯膦酸(suan)鹽脂質體的(de)(de)(de)半衰期很難確定。 脂質體難以從血(xue)液(ye)中(zhong)分離，并且(qie)它們在動物中(zhong)的(de)(de)(de)分布不均(jun)勻。 此外，氯膦酸(suan)鹽脂質體的(de)(de)(de)半衰期取決于巨噬細胞攝取和消化所需的(de)(de)(de)時間，這由許多因素決定，例如：動物疾病模型的(de)(de)(de)免疫全能性(xing)，給藥途(tu)徑，給藥劑量。
Q3.實(shi)驗清(qing)除巨噬細胞不(bu)成功，可能的(de)原因(yin)有哪些？
A3：氯(lv)膦酸鹽脂質體活(huo)性的失敗可能是由于(yu)各(ge)種原因：
1）有效期已過：超過有效期后無法確保活性;
2）在極(ji)端溫(wen)度(du)(du)下儲存：氯膦(lin)酸鹽(yan)脂質體應儲存在4到8攝氏(shi)度(du)(du)之間。冷(leng)凍脂質體或溫(wen)度(du)(du)高于30攝氏(shi)度(du)(du)會影響膜的穩定性(xing)并降(jiang)低氯膦(lin)酸鹽(yan)脂質體活性(xing);
3）脂(zhi)質體(ti)懸浮液(ye)的(de)稀釋：這會影響懸浮液(ye)中的(de)滲(shen)透壓，這可(ke)能導致脂(zhi)質體(ti)膜(mo)的(de)不穩(wen)定;
4）給藥方案不合理：給藥方案應仔細選擇并考慮多種因素，例如：
a.打算消耗的巨噬細胞的類型（例如庫普弗細胞，小膠質細胞，肺泡巨噬細胞，破骨細胞）。例如，可以通過氣管內給藥靶向肺泡巨噬細胞，而內皮/上皮屏障另一側的間質巨噬細胞不會被該給藥途徑靶向;
b.是(shi)否打算短(duan)期(qi)或長期(qi)消耗(hao)它們;
c.動物的(de)體重：較大(da)的(de)動物需(xu)要更多(duo)的(de)氯膦酸鹽(yan)脂質體才能達到清除(chu)閾(yu)值。
5）脂質(zhi)體懸浮(fu)液在(zai)使用(yong)前未(wei)重(zhong)新懸浮(fu)：脂質(zhi)體在(zai)儲存期間(jian)傾(qing)向于沉淀(dian)，確保在(zai)使用(yong)前輕(qing)輕(qing)搖動(dong)重(zhong)懸，以防止僅注射不含脂質(zhi)體的PBS溶液;
6）注射時出錯：確保注射是否成功非常重要。例如，如果您在尾靜脈注射期間看到鼓包形成，則可能是您注射到皮膚組織了，沒有注射到靜脈里。當腹膜內注射時，確保將脂質體懸浮液注射到腹腔內（而不是在腸內）。為了驗證脂質體是否已到達您想要的位置，可以使用熒光Dil脂質體;
7）檢驗清(qing)除的手(shou)段是否正(zheng)確(que)：需(xu)(xu)要(yao)選擇正(zheng)確(que)的標記(ji)來確(que)定清(qing)除是否成(cheng)功。此外，您需(xu)(xu)要(yao)考(kao)慮到每種給(gei)藥方案(an)和（動(dong)物）模型的巨噬細(xi)胞的消(xiao)耗(hao)和再增殖動(dong)力學不(bu)同(tong)。
Q4.實(shi)驗動物在注(zhu)射后立即死(si)亡，可能的原因有哪些？
A4：這很可能(neng)是(shi)由(you)于注射(she)了非均質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)沉(chen)淀脂質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)。 沉(chen)淀的(de)脂質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)可引起栓(shuan)塞，從而(er)部分或(huo)完(wan)全阻斷動脈或(huo)靜(jing)脈中的(de)血(xue)流。 由(you)于脂質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)在儲(chu)存期間容(rong)易(yi)沉(chen)淀，因此請確保在使用前(qian)顛(dian)倒混(hun)勻。
另一個原因可能是脂質體懸(xuan)浮(fu)液的溫度(du)。 脂質體應(ying)儲存在4到8攝氏度(du)之間(jian)，但應(ying)平衡(heng)到室溫后給藥。
注意：如果注射需要較長，脂質體可能在注射器中沉淀，當使用相同的注射器注射多只動物時，這可能導致差異劑量。
Q5.實驗動物在(zai)注射(she)后數小時或者數天死亡，可能(neng)的(de)原因是什么？
A5：這很(hen)可(ke)(ke)能(neng)是由(you)注射前(qian)或注射過程中的微(wei)生物污染(ran)引起的。當(dang)注射氯膦酸鹽(yan)脂質體(ti)時，巨噬(shi)細胞的清除(chu)可(ke)(ke)使(shi)動(dong)物更容易受到感(gan)染(ran)，尤(you)其是免疫缺陷動(dong)物。
Q6.如(ru)何存儲(chu)脂質(zhi)體懸液？
A6：儲存在4-8oC（或(huo)39-47oF）之間。 脂(zhi)質體懸(xuan)浮液不(bu)應該(gai)冷(leng)凍(dong)，也不(bu)應暴露在極端高溫下。
Q7.氯膦酸二鈉脂質體懸液(ye)的濃度是多少？
A7：平均而言，整個脂質體懸浮液的濃度為5mg氯膦酸鹽/ mL。 氯膦酸鹽以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂質體囊泡中。
Q8.脂質(zhi)體的粒徑和電荷是(shi)多少？
A8：所有(you)的脂質體(ti)（即(ji)氯膦酸鹽，PBS和(he)熒光Dil脂質體(ti)）都帶有(you)輕微(wei)帶負電，因此不會聚(ju)集在一起。 懸浮液中的脂質體(ti)沒(mei)有(you)按特(te)定(ding)的粒徑截留(liu)，脂質體(ti)的大小不等（最大3微(wei)米）。 平均而言(yan)，脂質體(ti)的大小為1.7微(wei)米。
Q9.溶解脂質體的(de)緩(huan)沖液是什么？
A9：所(suo)有的脂質體(ti)(ti)(ti)制劑（即氯膦酸鹽(yan)(yan)脂質體(ti)(ti)(ti)，對照脂質體(ti)(ti)(ti)和熒光Dil脂質體(ti)(ti)(ti)）懸(xuan)浮(fu)于無菌磷酸鹽(yan)(yan)緩沖鹽(yan)(yan)溶液(ye)（PBS）：10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4，>140mM NaCl中。
Q10.如何(he)檢測(ce)熒光Dil脂質(zhi)體(ti)？
A10：用(yong)(yong)熒(ying)光染料DiI標記(ji)的(de)(de)脂質體，作(zuo)為對照，可用(yong)(yong)于研究脂質體是否(fou)已通過所選的(de)(de)給藥方(fang)案達到靶向的(de)(de)巨噬細(xi)胞群。 熒(ying)光標記(ji)將顯示(shi)脂質體在組(zu)織(zhi)內的(de)(de)分布(bu)模式(shi)及其(qi)對巨噬細(xi)胞的(de)(de)攝(she)取。 Dil標記(ji)的(de)(de)脂質體可以通過流(liu)式(shi)細(xi)胞術和熒(ying)光顯微鏡檢測。 DiI分子的(de)(de)激發和發射分別為549和565nm。
Q11.發表研(yan)究成果時，如何引用(yong)LIPOSOMA的產品？
A11：當(dang)用LIPOSOMA的(de)脂質體制劑用于實驗(yan)并打算(suan)發表研究成果時，引用格式：“LIPOSOMA，the Netherlands（clodronateliposomes.com）”。
參考文獻：
1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.
2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.
3. Fleisch, H. (2000). Bisphosphonates in bone disease: from the laboratory to the patient. Elsevier.
4.Claassen, I., Van Rooijen, N., & Claassen, E. (1990). A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogeneous cell populations in vitro, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. Journal of immunological methods, 134(2), 153-161.
