巨噬(shi)細(xi)胞(bao)無論是在(zai)(zai)維(wei)持機(ji)體(ti)的(de)(de)生(sheng)理(li)(li)穩(wen)態(tai)還是斡(wo)旋組織的(de)(de)病理(li)(li)炎性(xing)(xing)，都發揮重要的(de)(de)作用。此外(wai)，巨噬(shi)細(xi)胞(bao)也(ye)促進多(duo)種疾病的(de)(de)病理(li)(li)生(sheng)理(li)(li)學(xue)，如(ru)包括(kuo)癌癥和各種炎癥性(xing)(xing)紊亂。巨噬(shi)細(xi)胞(bao)功(gong)能的(de)(de)多(duo)樣(yang)性(xing)(xing)也(ye)正如(ru)它(ta)起(qi)源的(de)(de)復(fu)雜性(xing)(xing)（當然爭議性(xing)(xing)更大），形態(tai)的(de)(de)異(yi)質性(xing)(xing)，表型(xing)的(de)(de)可(ke)(ke)塑性(xing)(xing)。因此，巨噬(shi)細(xi)胞(bao)作為一(yi)種具(ju)有可(ke)(ke)塑性(xing)(xing)，多(duo)能性(xing)(xing)和異(yi)質性(xing)(xing)的(de)(de)細(xi)胞(bao)群體(ti),在(zai)(zai)體(ti)內和體(ti)外(wai)不同的(de)(de)微環境影響下,表現出獨特的(de)(de)表型(xing)和功(gong)能，體(ti)現的(de)(de)是一(yi)個在(zai)(zai)時間和空間上受一(yi)系(xi)列機(ji)體(ti)免(mian)疫學(xue)網絡(luo)所調控的(de)(de)復(fu)雜動態(tai)連續性(xing)(xing)生(sheng)物學(xue)過程。
為了(le)更(geng)好的研究(jiu)巨噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)功能，設計(ji)研究(jiu)實驗時，要在(zai)時間上(shang)（疾病的發生和(he)發展）和(he)空間上(shang)（病灶的原位(wei)，組織，器官）考慮到巨噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)的起源，更(geng)新，補充，形態，表型(xing)和(he)功能的連(lian)續性，動(dong)態性和(he)網絡性。
Q1.為什么(me)Clodronate Liposomes（氯膦酸二鈉脂(zhi)質體(ti)）是研究巨(ju)噬細胞功能的(de)利(li)器？
A1：巨噬細胞在(zai)免疫系統中發揮重要(yao)作用。它們(men)主要(yao)通過(guo)可溶(rong)性分(fen)(fen)子，如細胞因子和(he)趨化(hua)(hua)因子的介導來調節許多非吞(tun)噬細胞的功(gong)能。巨噬細胞還通過(guo)攝取和(he)消化(hua)(hua)微(wei)生(sheng)物(wu)或非自身顆粒和(he)大(da)分(fen)(fen)子參與身體的“穩態(tai)”。內吞(tun)物(wu)的消化(hua)(hua)是由(you)其溶(rong)酶體酶介導的。
脂(zhi)質體是人工制備的(de)脂(zhi)質囊泡，由(you)夾帶水性隔室的(de)同心磷脂(zhi)雙層(ceng)組成。它們可用于包封溶解(jie)在水溶液中的(de)強(qiang)親水性分子，例如氯膦(lin)酸鹽(yan)，一種為(wei)人類應用開(kai)發的(de)無毒(du)二膦(lin)酸鹽(yan)。
注射后，氯(lv)(lv)(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)脂(zhi)質(zhi)體起(qi)到特(te)洛伊(yi)木馬(ma)的作用。巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞攝取氯(lv)(lv)(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)脂(zhi)質(zhi)體并消化脂(zhi)質(zhi)體膜。氯(lv)(lv)(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)不會(hui)被(bei)消化，并會(hui)留在巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞內。更多氯(lv)(lv)(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)將在巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞中積聚(ju)，因為它會(hui)攝取和消化更多的氯(lv)(lv)(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)脂(zhi)質(zhi)體。當氯(lv)(lv)(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)在細(xi)胞內聚(ju)集到一定(ding)的濃(nong)度后，氯(lv)(lv)(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)鹽(yan)會(hui)通過(guo)啟(qi)動其程序性細(xi)胞死(si)亡(wang)即細(xi)胞凋(diao)亡(wang)來清除巨(ju)噬(shi)(shi)細(xi)胞[1]。
通過選擇(ze)氯(lv)膦酸(suan)鹽脂質體(ti)的正確給藥(yao)途徑(jing)，給藥(yao)時間點，給藥(yao)頻率和給藥(yao)部位(wei)，可(ke)以清除特定器官或組織中的巨噬細(xi)胞。因此(ci)，氯(lv)膦酸(suan)鹽脂質體(ti)是研究巨噬細(xi)胞功(gong)能的極(ji)好(hao)工具[2]。
Q2.Clodronate Liposomes（氯膦酸二鈉脂質體）和Clodronate（氯膦酸二鈉）的半衰期是多少？
A2：死亡巨噬細(xi)(xi)胞釋放的氯(lv)膦(lin)酸鹽(yan)(yan)的半衰(shuai)期（t1 / 2）為數分(fen)鐘[3]，因為游(you)離(li)氯(lv)膦(lin)酸鹽(yan)(yan)通過(guo)腎臟(zang)系統迅(xun)速(su)從循環中(zhong)被清除。 由于難(nan)以通過(guo)細(xi)(xi)胞膜(mo)，游(you)離(li)氯(lv)膦(lin)酸鹽(yan)(yan)分(fen)子(zi)不易進入細(xi)(xi)胞，包括脂質體磷脂雙分(fen)子(zi)層。 然而，如果(guo)它們留在(zai)周(zhou)圍的介質中(zhong)，它們可能(neng)會(hui)慢慢積聚到細(xi)(xi)胞中(zhong)[4]。
氯膦酸鹽脂質體(ti)的(de)(de)(de)(de)半(ban)(ban)衰(shuai)期(qi)很難確(que)定(ding)。 脂質體(ti)難以從血液中分離，并(bing)且它們在(zai)動(dong)物(wu)中的(de)(de)(de)(de)分布不均勻。 此外(wai)，氯膦酸鹽脂質體(ti)的(de)(de)(de)(de)半(ban)(ban)衰(shuai)期(qi)取決于巨噬細胞攝取和(he)消化所需的(de)(de)(de)(de)時(shi)間，這由許多因素決定(ding)，例如：動(dong)物(wu)疾病模型的(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)全(quan)能(neng)性(xing)，給(gei)藥(yao)途(tu)徑(jing)，給(gei)藥(yao)劑量(liang)。
Q3.實驗清(qing)除巨噬細胞不(bu)成功(gong)，可能的(de)原因有哪(na)些？
A3：氯膦酸(suan)鹽脂(zhi)質體(ti)活(huo)性的(de)失敗可能是由于各種原(yuan)因：
1）有效期已過：超過有效期后無法確保活性;
2）在極端(duan)溫(wen)度下儲存：氯膦酸(suan)鹽(yan)脂質(zhi)體應儲存在4到8攝氏(shi)度之間。冷(leng)凍脂質(zhi)體或溫(wen)度高于30攝氏(shi)度會影響膜的(de)穩定性并降低氯膦酸(suan)鹽(yan)脂質(zhi)體活性;
3）脂質體(ti)(ti)懸(xuan)浮液的稀釋：這(zhe)會(hui)影響懸(xuan)浮液中的滲透壓，這(zhe)可能導致(zhi)脂質體(ti)(ti)膜的不穩定;
4）給藥方案不合理：給藥方案應仔細選擇并考慮多種因素，例如：
a.打算消耗的巨噬細胞的類型（例如庫普弗細胞，小膠質細胞，肺泡巨噬細胞，破骨細胞）。例如，可以通過氣管內給藥靶向肺泡巨噬細胞，而內皮/上皮屏障另一側的間質巨噬細胞不會被該給藥途徑靶向;
b.是(shi)否打算(suan)短期(qi)或長(chang)期(qi)消耗它們;
c.動物(wu)的(de)體重：較大的(de)動物(wu)需要更多的(de)氯膦酸(suan)鹽脂質體才(cai)能(neng)達到清除(chu)閾值。
5）脂質體懸浮液在使用前未重新懸浮：脂質體在儲存(cun)期間傾向于沉淀(dian)，確保在使用前輕輕搖動重懸，以防止僅注射不含脂質體的PBS溶液;
6）注射時出錯：確保注射是否成功非常重要。例如，如果您在尾靜脈注射期間看到鼓包形成，則可能是您注射到皮膚組織了，沒有注射到靜脈里。當腹膜內注射時，確保將脂質體懸浮液注射到腹腔內（而不是在腸內）。為了驗證脂質體是否已到達您想要的位置，可以使用熒光Dil脂質體;
7）檢驗(yan)清(qing)除的(de)手段是(shi)否正(zheng)確：需要(yao)選擇正(zheng)確的(de)標記來確定清(qing)除是(shi)否成功。此(ci)外(wai)，您需要(yao)考慮(lv)到每種給(gei)藥(yao)方案和（動物(wu)）模型的(de)巨噬細胞的(de)消耗(hao)和再增殖(zhi)動力學不同。
Q4.實驗動物在注射(she)后(hou)立即死亡，可(ke)能的原因有哪些？
A4：這很可能(neng)是由于注射了非均質的沉淀脂質體(ti)。 沉淀的脂質體(ti)可引起栓塞，從而部分或完(wan)全阻斷動脈或靜脈中的血流。 由于脂質體(ti)在儲存期(qi)間(jian)容易沉淀，因(yin)此請確保在使用前顛(dian)倒混(hun)勻。
另一個原因可能是脂(zhi)質體懸浮液(ye)的(de)溫(wen)度(du)。 脂(zhi)質體應(ying)儲存在4到8攝氏度(du)之間，但應(ying)平衡到室溫(wen)后給藥。
注意：如果注射需要較長，脂質體可能在注射器中沉淀，當使用相同的注射器注射多只動物時，這可能導致差異劑量。
Q5.實驗(yan)動(dong)物(wu)在(zai)注射后數小時或者數天死亡，可能的原(yuan)因是什么？
A5：這很(hen)可能是由注射(she)(she)(she)前或注射(she)(she)(she)過程中的微(wei)生物污(wu)染引起的。當注射(she)(she)(she)氯膦酸鹽脂(zhi)質體時(shi)，巨噬細胞的清(qing)除可使動物更容(rong)易受到感染，尤(you)其是免疫缺陷(xian)動物。
Q6.如何(he)存儲脂質體懸液(ye)？
A6：儲存(cun)在(zai)4-8oC（或39-47oF）之間。 脂(zhi)質(zhi)體懸浮液不應該(gai)冷凍，也不應暴露在(zai)極端(duan)高溫下。
Q7.氯膦酸二鈉脂質(zhi)體懸(xuan)液(ye)的濃度是多少？
A7：平均而言，整個脂質體懸浮液的濃度為5mg氯膦酸鹽/ mL。 氯膦酸鹽以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂質體囊泡中。
Q8.脂質體(ti)的粒徑和電荷是多少(shao)？
A8：所有的脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)(ti)（即氯(lv)膦(lin)酸(suan)鹽(yan)，PBS和熒光Dil脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)(ti)）都帶有輕微帶負電，因此不會聚(ju)集在一(yi)起。 懸浮液中的脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)(ti)沒(mei)有按特定(ding)的粒徑截留，脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)(ti)的大(da)小不等（最大(da)3微米(mi)）。 平均而(er)言，脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)(ti)的大(da)小為1.7微米(mi)。
Q9.溶解(jie)脂質(zhi)體(ti)的緩沖液是(shi)什么(me)？
A9：所有的脂質體(ti)制(zhi)劑（即氯膦(lin)酸鹽脂質體(ti)，對照脂質體(ti)和熒(ying)光Dil脂質體(ti)）懸(xuan)浮于無菌磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）：10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4，>140mM NaCl中。
Q10.如何檢測(ce)熒(ying)光Dil脂質體？
A10：用(yong)熒(ying)光染料DiI標(biao)記(ji)的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質體(ti)，作為對照，可用(yong)于研究脂(zhi)(zhi)質體(ti)是否已通(tong)過所選的(de)(de)(de)給(gei)藥方(fang)案達到靶向的(de)(de)(de)巨(ju)噬細(xi)胞群。 熒(ying)光標(biao)記(ji)將顯示脂(zhi)(zhi)質體(ti)在(zai)組(zu)織內的(de)(de)(de)分布模式及(ji)其對巨(ju)噬細(xi)胞的(de)(de)(de)攝取。 Dil標(biao)記(ji)的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質體(ti)可以通(tong)過流式細(xi)胞術和熒(ying)光顯微(wei)鏡(jing)檢測。 DiI分子的(de)(de)(de)激發(fa)和發(fa)射分別為549和565nm。
Q11.發表研究成果(guo)時，如何引用LIPOSOMA的產品？
A11：當用(yong)LIPOSOMA的脂質體(ti)制劑用(yong)于實驗并打算發表研(yan)究成果時，引用(yong)格(ge)式(shi)：“LIPOSOMA，the Netherlands（clodronateliposomes.com）”。
參考文獻：
1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.
2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.
3. Fleisch, H. (2000). Bisphosphonates in bone disease: from the laboratory to the patient. Elsevier.
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