巨(ju)噬(shi)細(xi)胞無論是(shi)在維持機體(ti)的(de)(de)(de)生理(li)(li)(li)穩(wen)態(tai)(tai)還是(shi)斡旋組織的(de)(de)(de)病(bing)理(li)(li)(li)炎性(xing)(xing),都發(fa)揮重要的(de)(de)(de)作用。此(ci)外(wai),巨(ju)噬(shi)細(xi)胞也促(cu)進多(duo)種疾病(bing)的(de)(de)(de)病(bing)理(li)(li)(li)生理(li)(li)(li)學,如包括(kuo)癌癥和各種炎癥性(xing)(xing)紊亂(luan)。巨(ju)噬(shi)細(xi)胞功(gong)能(neng)的(de)(de)(de)多(duo)樣性(xing)(xing)也正(zheng)如它起源(yuan)的(de)(de)(de)復雜性(xing)(xing)(當(dang)然爭議性(xing)(xing)更大),形態(tai)(tai)的(de)(de)(de)異(yi)質性(xing)(xing),表(biao)型的(de)(de)(de)可(ke)(ke)塑性(xing)(xing)。因此(ci),巨(ju)噬(shi)細(xi)胞作為一種具有(you)可(ke)(ke)塑性(xing)(xing),多(duo)能(neng)性(xing)(xing)和異(yi)質性(xing)(xing)的(de)(de)(de)細(xi)胞群(qun)體(ti),在體(ti)內和體(ti)外(wai)不同的(de)(de)(de)微環(huan)境影響(xiang)下,表(biao)現出獨特的(de)(de)(de)表(biao)型和功(gong)能(neng),體(ti)現的(de)(de)(de)是(shi)一個在時間和空(kong)間上受一系列機體(ti)免(mian)疫學網絡所調(diao)控的(de)(de)(de)復雜動(dong)態(tai)(tai)連續(xu)性(xing)(xing)生物學過(guo)程。
為了(le)更(geng)好(hao)的(de)研(yan)究(jiu)巨噬細(xi)胞功能,設計研(yan)究(jiu)實驗時,要在時間(jian)上(shang)(shang)(疾病的(de)發(fa)生和發(fa)展(zhan))和空間(jian)上(shang)(shang)(病灶(zao)的(de)原(yuan)位,組(zu)織,器官)考慮到巨噬細(xi)胞的(de)起(qi)源,更(geng)新,補充(chong),形態,表型和功能的(de)連(lian)續(xu)性(xing)(xing),動態性(xing)(xing)和網絡性(xing)(xing)。
Q1.為(wei)什么Clodronate Liposomes(氯膦酸二(er)鈉脂(zhi)質體)是研(yan)究巨噬(shi)細胞功能的利器(qi)?
A1:巨噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)在免疫系(xi)統中(zhong)發(fa)揮重要(yao)作用。它們主要(yao)通過(guo)可溶(rong)性分(fen)子,如細(xi)胞(bao)因子和(he)趨化(hua)因子的(de)介導來調節(jie)許多(duo)非(fei)吞(tun)噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)的(de)功(gong)能。巨噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)還通過(guo)攝取和(he)消化(hua)微生物或非(fei)自身顆(ke)粒和(he)大分(fen)子參(can)與身體的(de)“穩態”。內吞(tun)物的(de)消化(hua)是由(you)其溶(rong)酶體酶介導的(de)。
脂質體是人工(gong)制備的(de)脂質囊泡,由夾帶水性隔(ge)室的(de)同心(xin)磷脂雙層組成(cheng)。它們可(ke)用于包(bao)封溶(rong)解在水溶(rong)液中(zhong)的(de)強親水性分子(zi),例如氯(lv)膦酸(suan)鹽,一種為人類應用開(kai)發(fa)的(de)無(wu)毒二膦酸(suan)鹽。
注射后(hou),氯(lv)膦酸(suan)(suan)(suan)鹽脂(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)起到(dao)特洛伊(yi)木馬的(de)作用。巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)攝(she)取(qu)氯(lv)膦酸(suan)(suan)(suan)鹽脂(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)并消(xiao)化脂(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)膜(mo)。氯(lv)膦酸(suan)(suan)(suan)鹽不會(hui)被消(xiao)化,并會(hui)留(liu)在(zai)巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)內。更多氯(lv)膦酸(suan)(suan)(suan)鹽將(jiang)在(zai)巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)中積(ji)聚,因(yin)為它會(hui)攝(she)取(qu)和消(xiao)化更多的(de)氯(lv)膦酸(suan)(suan)(suan)鹽脂(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)。當(dang)氯(lv)膦酸(suan)(suan)(suan)鹽在(zai)細(xi)胞(bao)內聚集到(dao)一定(ding)的(de)濃度后(hou),氯(lv)膦酸(suan)(suan)(suan)鹽會(hui)通過啟動其(qi)程序性細(xi)胞(bao)死亡(wang)即細(xi)胞(bao)凋(diao)亡(wang)來(lai)清除(chu)巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)[1]。
通過(guo)選擇氯(lv)膦(lin)酸鹽(yan)脂(zhi)質體(ti)的正確給(gei)藥(yao)途徑,給(gei)藥(yao)時間(jian)點,給(gei)藥(yao)頻率和給(gei)藥(yao)部位,可以(yi)清除(chu)特定器官(guan)或組織中的巨噬(shi)細胞。因此,氯(lv)膦(lin)酸鹽(yan)脂(zhi)質體(ti)是研究巨噬(shi)細胞功能的極好工具[2]。
Q2.Clodronate Liposomes(氯(lv)膦酸二鈉(na)脂質體)和Clodronate(氯(lv)膦酸二鈉(na))的半(ban)衰期(qi)是多少?
A2:死(si)亡巨噬細胞(bao)釋放的(de)氯(lv)膦酸(suan)鹽的(de)半衰期(t1 / 2)為數分(fen)鐘[3],因為游離氯(lv)膦酸(suan)鹽通過(guo)腎臟(zang)系(xi)統迅(xun)速從循(xun)環中(zhong)被清除(chu)。 由(you)于難以(yi)通過(guo)細胞(bao)膜,游離氯(lv)膦酸(suan)鹽分(fen)子不易進入細胞(bao),包(bao)括脂(zhi)(zhi)質體磷脂(zhi)(zhi)雙分(fen)子層。 然而,如果(guo)它們留在周圍的(de)介(jie)質中(zhong),它們可能(neng)會(hui)慢(man)慢(man)積聚(ju)到細胞(bao)中(zhong)[4]。
氯膦酸(suan)鹽脂(zhi)質體(ti)的半衰(shuai)期(qi)很難確定。 脂(zhi)質體(ti)難以從血液中分(fen)離,并(bing)且(qie)它們在動物中的分(fen)布不均勻。 此外,氯膦酸(suan)鹽脂(zhi)質體(ti)的半衰(shuai)期(qi)取(qu)決于巨噬細胞攝取(qu)和(he)消化(hua)所需的時間,這(zhe)由許多因素決定,例如:動物疾病模(mo)型的免疫全能性,給藥(yao)途徑,給藥(yao)劑(ji)量。
Q3.實驗清除(chu)巨噬細胞(bao)不成功,可(ke)能(neng)的原(yuan)因有哪些?
A3:氯膦(lin)酸鹽脂(zhi)質體活性的(de)失敗可能是由于各種原因:
1)有效期已過:超過有效期后無法確保活性;
2)在(zai)(zai)極端溫度下儲存:氯膦酸鹽(yan)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)應(ying)儲存在(zai)(zai)4到8攝(she)氏(shi)度之間(jian)。冷凍脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)或溫度高(gao)于30攝(she)氏(shi)度會影響(xiang)膜的穩定性并降低氯膦酸鹽(yan)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)活性;
3)脂(zhi)質體懸浮(fu)液(ye)的稀釋:這會影響懸浮(fu)液(ye)中的滲透壓,這可(ke)能導致(zhi)脂(zhi)質體膜的不(bu)穩定;
4)給藥方案不合理:給藥方案應仔細選擇并考慮多種因素,例如:
a.打算消耗的巨噬細胞的類型(例如庫普弗細胞,小膠質細胞,肺泡巨噬細胞,破骨細胞)。例如,可以通過氣管內給藥靶向肺泡巨噬細胞,而內皮/上皮屏障另一側的間質巨噬細胞不會被該給藥途徑靶向;
b.是否打(da)算短期或長(chang)期消耗它(ta)們;
c.動物的(de)體重:較大的(de)動物需要更多(duo)的(de)氯膦酸鹽脂質體才能達(da)到清除閾值。
5)脂(zhi)質(zhi)體懸(xuan)浮(fu)液在(zai)使用前未重新(xin)懸(xuan)浮(fu):脂(zhi)質(zhi)體在(zai)儲存期間(jian)傾向于沉(chen)淀,確保(bao)在(zai)使用前輕輕搖動重懸(xuan),以防止僅(jin)注射不含脂(zhi)質(zhi)體的PBS溶(rong)液;
6)注射時出錯:確保注射是否成功非常重要。例如,如果您在尾靜脈注射期間看到鼓包形成,則可能是您注射到皮膚組織了,沒有注射到靜脈里。當腹膜內注射時,確保將脂質體懸浮液注射到腹腔內(而不是在腸內)。為了驗證脂質體是否已到達您想要的位置,可以使用熒光Dil脂質體;
7)檢驗清(qing)除的(de)(de)(de)手段是否正(zheng)確(que):需要選擇正(zheng)確(que)的(de)(de)(de)標記來確(que)定(ding)清(qing)除是否成功。此(ci)外,您需要考慮(lv)到每種(zhong)給藥方案和(動物)模型的(de)(de)(de)巨噬(shi)細胞的(de)(de)(de)消耗和再增殖動力學不同。
Q4.實驗(yan)動物(wu)在注射后立即(ji)死亡(wang),可能的原因(yin)有哪些?
A4:這(zhe)很可能是由(you)于(yu)注射了(le)非均質的沉(chen)淀脂(zhi)(zhi)質體(ti)(ti)。 沉(chen)淀的脂(zhi)(zhi)質體(ti)(ti)可引起栓塞,從而部分(fen)或完全阻(zu)斷動脈或靜脈中的血流。 由(you)于(yu)脂(zhi)(zhi)質體(ti)(ti)在儲存期間容易沉(chen)淀,因此請(qing)確保在使用前顛倒混(hun)勻。
另一個原因可能是脂質體懸浮液(ye)的(de)溫(wen)度(du)。 脂質體應(ying)儲存在4到8攝氏(shi)度(du)之間,但應(ying)平(ping)衡到室溫(wen)后給藥。
注意:如果注射需要較長,脂質體可能在注射器中沉淀,當使用相同的注射器注射多只動物時,這可能導致差異劑量。
Q5.實驗動物在注射后數小(xiao)時或者數天死亡,可能的(de)原因(yin)是(shi)什么?
A5:這很可(ke)能是(shi)由注(zhu)(zhu)射(she)前或注(zhu)(zhu)射(she)過程中(zhong)的微生物污(wu)染(ran)引起的。當注(zhu)(zhu)射(she)氯膦酸鹽脂質(zhi)體(ti)時,巨噬(shi)細胞的清除可(ke)使動物更(geng)容易(yi)受到感染(ran),尤其是(shi)免疫缺陷動物。
Q6.如何存儲脂(zhi)質體懸液?
A6:儲存在4-8oC(或39-47oF)之間(jian)。 脂質體懸浮液不應(ying)該冷凍,也不應(ying)暴露在極(ji)端高溫下。
Q7.氯膦酸二(er)鈉脂質(zhi)體懸液的濃度是多少?
A7:平均而言,整個脂質體懸浮液的濃度為5mg氯膦酸鹽/ mL。 氯膦酸鹽以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂質體囊泡中。
Q8.脂(zhi)質(zhi)體的粒徑(jing)和電(dian)荷(he)是(shi)多少?
A8:所有的(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)(即氯膦酸鹽,PBS和熒(ying)光Dil脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti))都帶(dai)(dai)有輕微帶(dai)(dai)負(fu)電,因此不(bu)會聚集(ji)在一起。 懸浮液中的(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)沒(mei)有按特(te)定的(de)粒徑截(jie)留,脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)的(de)大(da)小不(bu)等(最大(da)3微米(mi))。 平均(jun)而(er)言,脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)的(de)大(da)小為1.7微米(mi)。
Q9.溶解脂質體的(de)緩(huan)沖液是什么?
A9:所有的脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)制(zhi)劑(即氯膦酸(suan)鹽(yan)(yan)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti),對照脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)和(he)熒光(guang)Dil脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti))懸浮于無菌磷酸(suan)鹽(yan)(yan)緩(huan)沖鹽(yan)(yan)溶液(PBS):10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4,>140mM NaCl中。
Q10.如何檢測熒光Dil脂質(zhi)體?
A10:用熒光(guang)染(ran)料DiI標記(ji)的(de)(de)(de)脂質(zhi)(zhi)體,作為對(dui)照,可(ke)用于研究脂質(zhi)(zhi)體是(shi)否(fou)已通(tong)過(guo)所選的(de)(de)(de)給藥方案(an)達到靶向的(de)(de)(de)巨(ju)噬細胞(bao)群(qun)。 熒光(guang)標記(ji)將顯(xian)示(shi)脂質(zhi)(zhi)體在組織(zhi)內的(de)(de)(de)分(fen)布模式及其(qi)對(dui)巨(ju)噬細胞(bao)的(de)(de)(de)攝取。 Dil標記(ji)的(de)(de)(de)脂質(zhi)(zhi)體可(ke)以通(tong)過(guo)流式細胞(bao)術(shu)和熒光(guang)顯(xian)微(wei)鏡檢測。 DiI分(fen)子的(de)(de)(de)激(ji)發(fa)(fa)和發(fa)(fa)射分(fen)別(bie)為549和565nm。
Q11.發(fa)表(biao)研究成果(guo)時,如何(he)引用LIPOSOMA的產品(pin)?
A11:當用(yong)LIPOSOMA的(de)脂質體制劑用(yong)于實(shi)驗并打算發表研究成果時,引用(yong)格式:“LIPOSOMA,the Netherlands(clodronateliposomes.com)”。
參考文獻:
1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.
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