巨(ju)(ju)噬细胞无论是在(zai)(zai)维持(chi)机体(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生理(li)(li)稳态还是斡旋组(zu)织的(de)(de)(de)(de)(de)(de)病(bing)理(li)(li)炎性(xing)(xing)，都发挥重要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用。此外(wai)，巨(ju)(ju)噬细胞也促进多(duo)种(zhong)疾(ji)病(bing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)病(bing)理(li)(li)生理(li)(li)学，如包括(kuo)癌症和各(ge)种(zhong)炎症性(xing)(xing)紊乱。巨(ju)(ju)噬细胞功能(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)多(duo)样性(xing)(xing)也正如它起源的(de)(de)(de)(de)(de)(de)复杂性(xing)(xing)（当(dang)然(ran)争议性(xing)(xing)更大），形(xing)态的(de)(de)(de)(de)(de)(de)异质性(xing)(xing)，表型的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可塑(su)性(xing)(xing)。因此，巨(ju)(ju)噬细胞作(zuo)为(wei)一种(zhong)具有可塑(su)性(xing)(xing)，多(duo)能(neng)性(xing)(xing)和异质性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)细胞群体(ti),在(zai)(zai)体(ti)内和体(ti)外(wai)不同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)微环境影(ying)响下(xia),表现(xian)出独特的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表型和功能(neng)，体(ti)现(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)是一个在(zai)(zai)时(shi)间(jian)和空间(jian)上受一系列机体(ti)免(mian)疫学网络(luo)所调控的(de)(de)(de)(de)(de)(de)复杂动态连续性(xing)(xing)生物学过程。
为了更好的(de)研究巨(ju)(ju)噬细(xi)胞功能，设(she)计研究实验时，要(yao)在时间上(shang)（疾病的(de)发生和发展）和空间上(shang)（病灶的(de)原位，组织，器(qi)官(guan)）考虑到(dao)巨(ju)(ju)噬细(xi)胞的(de)起源(yuan)，更新，补(bu)充，形(xing)态，表型(xing)和功能的(de)连续性，动态性和网络性。
Q1.为什(shen)么Clodronate Liposomes（氯(lv)膦酸二钠脂质体）是(shi)研究巨噬细胞功能的利(li)器？
A1：巨噬细胞(bao)在(zai)免疫系统中发挥重要作(zuo)用。它(ta)们主要通(tong)过(guo)可溶性分(fen)子(zi)(zi)，如(ru)细胞(bao)因(yin)子(zi)(zi)和趋化因(yin)子(zi)(zi)的(de)介导来调(diao)节许多非吞噬细胞(bao)的(de)功(gong)能。巨噬细胞(bao)还(hai)通(tong)过(guo)摄(she)取和消化微生物或非自身(shen)颗粒和大分(fen)子(zi)(zi)参与身(shen)体的(de)“稳态”。内(nei)吞物的(de)消化是(shi)由其溶酶(mei)体酶(mei)介导的(de)。
脂(zhi)质体是(shi)人(ren)(ren)工制备(bei)的(de)脂(zhi)质囊泡，由夹(jia)带(dai)水性隔室(shi)的(de)同心磷脂(zhi)双(shuang)层组成(cheng)。它(ta)们可用(yong)于包封溶(rong)解在水溶(rong)液中的(de)强(qiang)亲水性分子(zi)，例如(ru)氯膦(lin)酸盐(yan)，一种为人(ren)(ren)类应用(yong)开发的(de)无毒(du)二膦(lin)酸盐(yan)。
注射后(hou)，氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)盐脂质(zhi)体(ti)(ti)起到(dao)特洛伊木马(ma)的作(zuo)用。巨(ju)噬(shi)细(xi)胞(bao)摄(she)取氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)盐脂质(zhi)体(ti)(ti)并(bing)消化脂质(zhi)体(ti)(ti)膜。氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)盐不(bu)会(hui)(hui)被消化，并(bing)会(hui)(hui)留在巨(ju)噬(shi)细(xi)胞(bao)内。更(geng)多氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)盐将在巨(ju)噬(shi)细(xi)胞(bao)中积聚，因为它会(hui)(hui)摄(she)取和消化更(geng)多的氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)盐脂质(zhi)体(ti)(ti)。当氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)盐在细(xi)胞(bao)内聚集(ji)到(dao)一(yi)定的浓(nong)度后(hou)，氯(lv)(lv)(lv)膦(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)盐会(hui)(hui)通过(guo)启动其程序性细(xi)胞(bao)死亡即细(xi)胞(bao)凋亡来清除巨(ju)噬(shi)细(xi)胞(bao)[1]。
通过(guo)选(xuan)择氯膦酸盐脂质(zhi)体的正确给药(yao)(yao)途径，给药(yao)(yao)时间点，给药(yao)(yao)频率和给药(yao)(yao)部位，可以清(qing)除特定器官(guan)或组织(zhi)中的巨噬(shi)细胞(bao)。因此(ci)，氯膦酸盐脂质(zhi)体是研(yan)究巨噬(shi)细胞(bao)功能的极好(hao)工具[2]。
Q2.Clodronate Liposomes（氯(lv)膦酸(suan)二(er)(er)钠脂质体(ti)）和Clodronate（氯(lv)膦酸(suan)二(er)(er)钠）的半衰期(qi)是多少？
A2：死亡巨噬细胞释放的氯(lv)膦(lin)(lin)酸(suan)盐的半(ban)衰期（t1 / 2）为数(shu)分钟[3]，因为游(you)离氯(lv)膦(lin)(lin)酸(suan)盐通过肾脏(zang)系(xi)统迅(xun)速从循(xun)环中被清除。 由于难以(yi)通过细胞膜，游(you)离氯(lv)膦(lin)(lin)酸(suan)盐分子不易(yi)进入(ru)细胞，包括脂(zhi)质体磷脂(zhi)双分子层。 然而，如果它(ta)们(men)留在周围(wei)的介质中，它(ta)们(men)可能会慢慢积聚到细胞中[4]。
氯(lv)膦(lin)酸盐脂质体的(de)半(ban)衰(shuai)期很难(nan)确(que)定。 脂质体难(nan)以(yi)从血液中分(fen)离，并(bing)且它们在(zai)动物中的(de)分(fen)布不均匀。 此外，氯(lv)膦(lin)酸盐脂质体的(de)半(ban)衰(shuai)期取决于巨噬细(xi)胞(bao)摄取和消化(hua)所需的(de)时间，这由(you)许多因素决定，例如：动物疾病模型的(de)免(mian)疫全能性，给药(yao)途(tu)径，给药(yao)剂量(liang)。
Q3.实(shi)验清除巨噬细胞不成功(gong)，可能的原(yuan)因有哪(na)些？
A3：氯(lv)膦(lin)酸盐(yan)脂质体(ti)活性(xing)的(de)失败可能是(shi)由(you)于各种原因(yin)：
1）有效期已过：超过有效期后无法确保活性;
2）在极端温度(du)(du)下储存：氯膦酸盐(yan)脂(zhi)质体(ti)应储存在4到(dao)8摄(she)氏度(du)(du)之间。冷冻脂(zhi)质体(ti)或温度(du)(du)高于30摄(she)氏度(du)(du)会影(ying)响膜的(de)稳定性(xing)并降(jiang)低(di)氯膦酸盐(yan)脂(zhi)质体(ti)活性(xing);
3）脂质体悬浮(fu)液的稀释：这(zhei)会影响(xiang)悬浮(fu)液中的渗透压，这(zhei)可能导(dao)致脂质体膜的不稳定;
4）给药方案不合理：给药方案应仔细选择并考虑多种因素，例如：
a.打算消耗的巨噬细胞的类型（例如库普弗细胞，小胶质细胞，肺泡巨噬细胞，破骨细胞）。例如，可以通过气管内给药靶向肺泡巨噬细胞，而内皮/上皮屏障另一侧的间质巨噬细胞不会被该给药途径靶向;
b.是否打算短期或长期消耗它们;
c.动物的(de)体重：较(jiao)大(da)的(de)动物需(xu)要更(geng)多的(de)氯膦酸盐脂质体才能达(da)到(dao)清除阈(yu)值。
5）脂(zhi)质体悬(xuan)浮(fu)液在(zai)使用(yong)前未重(zhong)新(xin)悬(xuan)浮(fu)：脂(zhi)质体在(zai)储存期间(jian)倾向于沉淀，确保在(zai)使用(yong)前轻轻摇动重(zhong)悬(xuan)，以防止仅注射(she)不含脂(zhi)质体的(de)PBS溶(rong)液;
6）注射时出错：确保注射是否成功非常重要。例如，如果您在尾静脉注射期间看到鼓包形成，则可能是您注射到皮肤组织了，没有注射到静脉里。当腹膜内注射时，确保将脂质体悬浮液注射到腹腔内（而不是在肠内）。为了验证脂质体是否已到达您想要的位置，可以使用荧光Dil脂质体;
7）检验清(qing)除的(de)手段是(shi)否(fou)正确(que)：需要选择正确(que)的(de)标记来确(que)定(ding)清(qing)除是(shi)否(fou)成(cheng)功(gong)。此外(wai)，您需要考虑(lv)到每种给药方案(an)和（动物）模型的(de)巨噬细胞的(de)消耗(hao)和再增(zeng)殖动力学不同。
Q4.实验动物(wu)在注射(she)后(hou)立即死(si)亡，可能的原因有哪些？
A4：这很可能是(shi)由于注射了(le)非均质的(de)(de)沉(chen)(chen)淀(dian)(dian)脂质体。 沉(chen)(chen)淀(dian)(dian)的(de)(de)脂质体可引起栓塞，从而(er)部分或完(wan)全阻断动脉或静脉中的(de)(de)血流。 由于脂质体在(zai)(zai)储(chu)存期间容(rong)易沉(chen)(chen)淀(dian)(dian)，因(yin)此(ci)请确保在(zai)(zai)使用前颠倒混匀。
另一个原(yuan)因(yin)可能是(shi)脂质体悬(xuan)浮(fu)液(ye)的温度。 脂质体应(ying)储存(cun)在4到8摄氏(shi)度之间，但应(ying)平衡到室(shi)温后给药。
注意：如果注射需要较长，脂质体可能在注射器中沉淀，当使用相同的注射器注射多只动物时，这可能导致差异剂量。
Q5.实验(yan)动物在注射后数(shu)(shu)小时或者(zhe)数(shu)(shu)天死(si)亡，可能的原(yuan)因是什么？
A5：这很可能是由(you)注(zhu)射(she)前或注(zhu)射(she)过程中(zhong)的微生物(wu)污染引起的。当注(zhu)射(she)氯膦(lin)酸盐脂质体(ti)时(shi)，巨噬细胞的清除可使动物(wu)更容易受(shou)到感染，尤其是免(mian)疫缺(que)陷动物(wu)。
Q6.如何存储脂质体悬液？
A6：储(chu)存(cun)在4-8ºC（或39-47ºF）之间。 脂质体悬浮液不(bu)(bu)应该(gai)冷冻(dong)，也不(bu)(bu)应暴露(lu)在极端高温(wen)下。
Q7.氯膦酸(suan)二(er)钠脂质体悬液的浓度是多少(shao)？
A7：平均而言，整个脂质体悬浮液的浓度为5mg氯膦酸盐/ mL。 氯膦酸盐以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂质体囊泡中。
Q8.脂质(zhi)体的粒径和电(dian)荷是多少(shao)？
A8：所有(you)的(de)脂(zhi)质体(ti)（即氯膦酸盐，PBS和荧(ying)光Dil脂(zhi)质体(ti)）都带(dai)有(you)轻微带(dai)负电，因此不会聚集在一起。 悬浮液(ye)中的(de)脂(zhi)质体(ti)没(mei)有(you)按特定的(de)粒径(jing)截(jie)留(liu)，脂(zhi)质体(ti)的(de)大小(xiao)(xiao)不等（最大3微米(mi)）。 平(ping)均而言，脂(zhi)质体(ti)的(de)大小(xiao)(xiao)为(wei)1.7微米(mi)。
Q9.溶(rong)解脂质体的缓冲液是什么？
A9：所有(you)的脂(zhi)(zhi)质体制剂（即氯膦酸盐脂(zhi)(zhi)质体，对(dui)照脂(zhi)(zhi)质体和(he)荧光Dil脂(zhi)(zhi)质体）悬(xuan)浮于(yu)无菌磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）：10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4，>140mM NaCl中。
Q10.如(ru)何检(jian)测荧光Dil脂(zhi)质体？
A10：用荧光染料DiI标(biao)记的脂(zhi)(zhi)质(zhi)(zhi)体，作为(wei)对(dui)照，可用于研究脂(zhi)(zhi)质(zhi)(zhi)体是否已通过所选的给(ji)药方(fang)案达到靶(ba)向的巨(ju)噬细胞群。 荧光标(biao)记将(jiang)显示脂(zhi)(zhi)质(zhi)(zhi)体在组织(zhi)内的分(fen)(fen)布模(mo)式(shi)及其对(dui)巨(ju)噬细胞的摄取(qu)。 Dil标(biao)记的脂(zhi)(zhi)质(zhi)(zhi)体可以通过流式(shi)细胞术和(he)荧光显微镜检测。 DiI分(fen)(fen)子的激发(fa)和(he)发(fa)射分(fen)(fen)别为(wei)549和(he)565nm。
Q11.发(fa)表研究(jiu)成果时，如(ru)何引用LIPOSOMA的产品？
A11：当用LIPOSOMA的(de)脂质体制剂(ji)用于实验并打算发(fa)表研究成果时，引用格式：“LIPOSOMA，the Netherlands（clodronateliposomes.com）”。
参考文献：
1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.
2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.
3. Fleisch, H. (2000). Bisphosphonates in bone disease: from the laboratory to the patient. Elsevier.
4.Claassen, I., Van Rooijen, N., & Claassen, E. (1990). A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogeneous cell populations in vitro, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. Journal of immunological methods, 134(2), 153-161.
