巨(ju)噬(shi)細胞(bao)無論是(shi)在維(wei)持(chi)機體(ti)的(de)(de)生理穩態(tai)還是(shi)斡旋組織(zhi)的(de)(de)病(bing)理炎(yan)性(xing)(xing)(xing)(xing),都發揮重要的(de)(de)作(zuo)用(yong)。此(ci)外,巨(ju)噬(shi)細胞(bao)也(ye)促進多種疾病(bing)的(de)(de)病(bing)理生理學(xue),如包括癌癥和各種炎(yan)癥性(xing)(xing)(xing)(xing)紊亂(luan)。巨(ju)噬(shi)細胞(bao)功能(neng)(neng)的(de)(de)多樣性(xing)(xing)(xing)(xing)也(ye)正如它起源的(de)(de)復(fu)(fu)雜性(xing)(xing)(xing)(xing)(當然爭議性(xing)(xing)(xing)(xing)更大),形(xing)態(tai)的(de)(de)異質(zhi)性(xing)(xing)(xing)(xing),表型(xing)的(de)(de)可(ke)塑(su)(su)性(xing)(xing)(xing)(xing)。因此(ci),巨(ju)噬(shi)細胞(bao)作(zuo)為(wei)一(yi)種具有可(ke)塑(su)(su)性(xing)(xing)(xing)(xing),多能(neng)(neng)性(xing)(xing)(xing)(xing)和異質(zhi)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)細胞(bao)群(qun)體(ti),在體(ti)內和體(ti)外不同(tong)的(de)(de)微環(huan)境(jing)影響下,表現出獨特的(de)(de)表型(xing)和功能(neng)(neng),體(ti)現的(de)(de)是(shi)一(yi)個(ge)在時(shi)間和空間上受一(yi)系列機體(ti)免疫學(xue)網絡所調控的(de)(de)復(fu)(fu)雜動態(tai)連續性(xing)(xing)(xing)(xing)生物學(xue)過程。
為了更(geng)好(hao)的(de)研究巨噬細胞(bao)功(gong)能(neng)(neng),設(she)計(ji)研究實驗時,要在時間(jian)(jian)上(shang)(疾(ji)病的(de)發(fa)生和(he)發(fa)展(zhan))和(he)空間(jian)(jian)上(shang)(病灶(zao)的(de)原位,組(zu)織,器官(guan))考(kao)慮到(dao)巨噬細胞(bao)的(de)起源,更(geng)新,補充,形態(tai)(tai),表(biao)型和(he)功(gong)能(neng)(neng)的(de)連續(xu)性,動(dong)態(tai)(tai)性和(he)網絡性。
Q1.為什么(me)Clodronate Liposomes(氯(lv)膦酸二鈉脂(zhi)質(zhi)體(ti))是研究(jiu)巨噬細胞功能的(de)利(li)器(qi)?
A1:巨噬(shi)細胞(bao)在(zai)免疫系統中(zhong)發(fa)揮重(zhong)要作用。它們(men)主要通過可溶性分(fen)子(zi),如細胞(bao)因(yin)子(zi)和趨化(hua)因(yin)子(zi)的(de)(de)介導來調節許多(duo)非吞(tun)噬(shi)細胞(bao)的(de)(de)功能。巨噬(shi)細胞(bao)還(huan)通過攝取和消化(hua)微生物或非自身顆粒和大分(fen)子(zi)參與(yu)身體的(de)(de)“穩態(tai)”。內吞(tun)物的(de)(de)消化(hua)是由其溶酶(mei)體酶(mei)介導的(de)(de)。
脂質(zhi)體是人工制備的脂質(zhi)囊(nang)泡,由夾帶水性(xing)隔(ge)室的同心(xin)磷脂雙層組成。它們可用于包封溶解在水溶液(ye)中的強親(qin)水性(xing)分子,例如氯膦(lin)酸鹽(yan)(yan),一種為(wei)人類(lei)應用開發(fa)的無毒(du)二膦(lin)酸鹽(yan)(yan)。
注射后,氯(lv)膦酸(suan)(suan)鹽脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)起到特洛(luo)伊木馬(ma)的(de)作用。巨噬(shi)細(xi)胞(bao)攝取(qu)(qu)氯(lv)膦酸(suan)(suan)鹽脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)并消(xiao)化(hua)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)膜。氯(lv)膦酸(suan)(suan)鹽不會(hui)(hui)被消(xiao)化(hua),并會(hui)(hui)留在(zai)巨噬(shi)細(xi)胞(bao)內。更多氯(lv)膦酸(suan)(suan)鹽將(jiang)在(zai)巨噬(shi)細(xi)胞(bao)中(zhong)積(ji)聚,因為它會(hui)(hui)攝取(qu)(qu)和消(xiao)化(hua)更多的(de)氯(lv)膦酸(suan)(suan)鹽脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)。當氯(lv)膦酸(suan)(suan)鹽在(zai)細(xi)胞(bao)內聚集到一定(ding)的(de)濃度后,氯(lv)膦酸(suan)(suan)鹽會(hui)(hui)通過啟動其程序(xu)性細(xi)胞(bao)死亡即(ji)細(xi)胞(bao)凋亡來清除巨噬(shi)細(xi)胞(bao)[1]。
通(tong)過選擇氯膦酸鹽脂質體的正確給(gei)藥(yao)途徑,給(gei)藥(yao)時間點,給(gei)藥(yao)頻(pin)率和(he)給(gei)藥(yao)部位,可(ke)以(yi)清除特定器(qi)官或(huo)組織中的巨噬(shi)細(xi)胞(bao)。因此(ci),氯膦酸鹽脂質體是研(yan)究巨噬(shi)細(xi)胞(bao)功能(neng)的極好工(gong)具[2]。
Q2.Clodronate Liposomes(氯(lv)膦(lin)酸(suan)二鈉(na)脂質體)和(he)Clodronate(氯(lv)膦(lin)酸(suan)二鈉(na))的半衰期是多少?
A2:死(si)亡巨噬細胞(bao)(bao)釋放的(de)氯(lv)膦(lin)酸鹽的(de)半衰期(t1 / 2)為數分(fen)(fen)鐘[3],因為游(you)離氯(lv)膦(lin)酸鹽通過腎臟系(xi)統(tong)迅(xun)速從(cong)循環(huan)中(zhong)(zhong)被清除。 由于難以通過細胞(bao)(bao)膜(mo),游(you)離氯(lv)膦(lin)酸鹽分(fen)(fen)子不易(yi)進入細胞(bao)(bao),包括(kuo)脂質體磷脂雙分(fen)(fen)子層。 然而,如果它們(men)留在周(zhou)圍(wei)的(de)介(jie)質中(zhong)(zhong),它們(men)可(ke)能會慢(man)(man)慢(man)(man)積聚到細胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)[4]。
氯(lv)膦酸鹽脂質體(ti)的半(ban)(ban)衰期(qi)很難確定。 脂質體(ti)難以(yi)從血液中分離,并(bing)且它們在動物(wu)中的分布不均勻。 此外,氯(lv)膦酸鹽脂質體(ti)的半(ban)(ban)衰期(qi)取(qu)決于巨噬細胞攝取(qu)和(he)消(xiao)化所需的時間,這由許多因素決定,例如:動物(wu)疾病模型的免(mian)疫(yi)全能性,給藥途徑,給藥劑量。
Q3.實(shi)驗清除巨噬細胞不成功,可能的原因有哪些(xie)?
A3:氯膦酸鹽(yan)脂質體活性(xing)的失敗可能(neng)是由于各種原因(yin):
1)有效期已過:超過有效期后無法確保活性;
2)在(zai)極端溫度(du)下儲存:氯膦酸鹽脂質(zhi)(zhi)體應儲存在(zai)4到8攝氏度(du)之(zhi)間。冷凍(dong)脂質(zhi)(zhi)體或溫度(du)高(gao)于30攝氏度(du)會影響膜(mo)的穩定性并降(jiang)低氯膦酸鹽脂質(zhi)(zhi)體活性;
3)脂質體懸(xuan)浮液的稀釋:這會影響懸(xuan)浮液中的滲透(tou)壓,這可能(neng)導致(zhi)脂質體膜的不穩定(ding);
4)給藥方案不合理:給藥方案應仔細選擇并考慮多種因素,例如:
a.打算消耗的巨噬細胞的類型(例如庫普弗細胞,小膠質細胞,肺泡巨噬細胞,破骨細胞)。例如,可以通過氣管內給藥靶向肺泡巨噬細胞,而內皮/上皮屏障另一側的間質巨噬細胞不會被該給藥途徑靶向;
b.是否(fou)打算短期(qi)或長期(qi)消耗它們;
c.動物的(de)體重:較大的(de)動物需要更多(duo)的(de)氯膦酸鹽脂質體才能達(da)到清除(chu)閾值。
5)脂(zhi)質(zhi)體懸浮液在(zai)使(shi)用前(qian)未重新懸浮:脂(zhi)質(zhi)體在(zai)儲存期間傾向于沉淀,確保在(zai)使(shi)用前(qian)輕(qing)輕(qing)搖動重懸,以防止僅注(zhu)射不(bu)含脂(zhi)質(zhi)體的(de)PBS溶液;
6)注射時出錯:確保注射是否成功非常重要。例如,如果您在尾靜脈注射期間看到鼓包形成,則可能是您注射到皮膚組織了,沒有注射到靜脈里。當腹膜內注射時,確保將脂質體懸浮液注射到腹腔內(而不是在腸內)。為了驗證脂質體是否已到達您想要的位置,可以使用熒光Dil脂質體;
7)檢(jian)驗清(qing)除的手段是否(fou)正確:需(xu)(xu)要(yao)選擇正確的標(biao)記來確定清(qing)除是否(fou)成功。此外,您(nin)需(xu)(xu)要(yao)考慮到每(mei)種給藥方案和(動物)模型的巨噬細胞的消耗和再(zai)增殖動力學(xue)不同。
Q4.實驗(yan)動物在注射后立即死亡,可能的原(yuan)因有哪些?
A4:這很(hen)可能是由(you)于注射了非均質的(de)沉(chen)(chen)淀脂(zhi)質體(ti)。 沉(chen)(chen)淀的(de)脂(zhi)質體(ti)可引起栓塞,從而部分或(huo)完全阻(zu)斷動脈(mo)或(huo)靜(jing)脈(mo)中的(de)血(xue)流。 由(you)于脂(zhi)質體(ti)在(zai)儲存期間(jian)容易沉(chen)(chen)淀,因此(ci)請確保在(zai)使用前顛(dian)倒混(hun)勻。
另一個原因可能是脂質體懸(xuan)浮液(ye)的溫(wen)(wen)度。 脂質體應儲存(cun)在(zai)4到(dao)8攝氏度之間(jian),但應平(ping)衡到(dao)室(shi)溫(wen)(wen)后給藥。
注意:如果注射需要較長,脂質體可能在注射器中沉淀,當使用相同的注射器注射多只動物時,這可能導致差異劑量。
Q5.實驗動物在(zai)注射后數小時或者(zhe)數天死亡,可能的(de)原因是(shi)什么?
A5:這(zhe)很(hen)可(ke)能是由注射前或注射過程(cheng)中的微生物(wu)污染(ran)(ran)引起的。當注射氯膦酸鹽脂質體(ti)時,巨噬細胞(bao)的清(qing)除可(ke)使(shi)動(dong)物(wu)更容易受到感染(ran)(ran),尤(you)其是免疫缺(que)陷動(dong)物(wu)。
Q6.如(ru)何(he)存儲脂質(zhi)體(ti)懸液?
A6:儲存在(zai)4-8oC(或39-47oF)之間。 脂(zhi)質(zhi)體懸(xuan)浮液不(bu)應該冷凍,也不(bu)應暴露在(zai)極端高溫下。
Q7.氯(lv)膦酸(suan)二(er)鈉脂質體懸液的(de)濃度是多少?
A7:平均而言,整個脂質體懸浮液的濃度為5mg氯膦酸鹽/ mL。 氯膦酸鹽以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂質體囊泡中。
Q8.脂質體(ti)的粒徑和(he)電荷是多(duo)少?
A8:所有(you)的(de)脂質(zhi)體(即氯膦(lin)酸鹽(yan),PBS和熒光Dil脂質(zhi)體)都帶(dai)有(you)輕微(wei)帶(dai)負電,因(yin)此不(bu)會(hui)聚集在一起(qi)。 懸(xuan)浮(fu)液中的(de)脂質(zhi)體沒有(you)按特定的(de)粒徑截留,脂質(zhi)體的(de)大(da)小(xiao)不(bu)等(最大(da)3微(wei)米)。 平(ping)均而言(yan),脂質(zhi)體的(de)大(da)小(xiao)為(wei)1.7微(wei)米。
Q9.溶解脂質體(ti)的緩沖液是(shi)什么?
A9:所(suo)有的脂(zhi)質(zhi)體制(zhi)劑(即氯膦酸鹽脂(zhi)質(zhi)體,對(dui)照(zhao)脂(zhi)質(zhi)體和熒光Dil脂(zhi)質(zhi)體)懸浮于無(wu)菌磷酸鹽緩沖(chong)鹽溶液(PBS):10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4,>140mM NaCl中(zhong)。
Q10.如(ru)何檢測熒光Dil脂質體?
A10:用(yong)熒(ying)光染料DiI標記(ji)的脂質體(ti),作(zuo)為(wei)對(dui)照,可用(yong)于研究脂質體(ti)是否已通(tong)(tong)過所選的給藥(yao)方(fang)案達到靶向的巨噬細(xi)胞(bao)群。 熒(ying)光標記(ji)將顯示脂質體(ti)在(zai)組織內的分布(bu)模式(shi)(shi)及(ji)其對(dui)巨噬細(xi)胞(bao)的攝取。 Dil標記(ji)的脂質體(ti)可以通(tong)(tong)過流式(shi)(shi)細(xi)胞(bao)術和(he)熒(ying)光顯微鏡(jing)檢測。 DiI分子(zi)的激發(fa)和(he)發(fa)射分別為(wei)549和(he)565nm。
Q11.發(fa)表(biao)研究成果(guo)時,如(ru)何引用LIPOSOMA的產品?
A11:當用LIPOSOMA的脂質體制劑(ji)用于實驗并打算發表研究成果時,引用格式:“LIPOSOMA,the Netherlands(clodronateliposomes.com)”。
參考文獻:
1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.
2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.
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4.Claassen, I., Van Rooijen, N., & Claassen, E. (1990). A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogeneous cell populations in vitro, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. Journal of immunological methods, 134(2), 153-161.