巨噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)無論(lun)是(shi)在(zai)(zai)維持機體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)生(sheng)(sheng)理(li)穩態(tai)還(huan)是(shi)斡(wo)旋組(zu)織的(de)(de)病理(li)炎(yan)性(xing)(xing)，都發揮重要的(de)(de)作用。此外(wai)，巨噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)也促進多種疾病的(de)(de)病理(li)生(sheng)(sheng)理(li)學(xue)，如包(bao)括(kuo)癌癥和(he)各種炎(yan)癥性(xing)(xing)紊亂。巨噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)功能(neng)的(de)(de)多樣性(xing)(xing)也正(zheng)如它(ta)起源的(de)(de)復(fu)雜(za)性(xing)(xing)（當然爭議性(xing)(xing)更大），形態(tai)的(de)(de)異質(zhi)性(xing)(xing)，表型(xing)的(de)(de)可塑性(xing)(xing)。因此，巨噬(shi)(shi)細(xi)胞(bao)作為一(yi)種具(ju)有可塑性(xing)(xing)，多能(neng)性(xing)(xing)和(he)異質(zhi)性(xing)(xing)的(de)(de)細(xi)胞(bao)群體(ti)(ti)(ti),在(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)內和(he)體(ti)(ti)(ti)外(wai)不同的(de)(de)微(wei)環境影(ying)響下(xia),表現出獨特的(de)(de)表型(xing)和(he)功能(neng)，體(ti)(ti)(ti)現的(de)(de)是(shi)一(yi)個在(zai)(zai)時間和(he)空間上受一(yi)系列機體(ti)(ti)(ti)免(mian)疫學(xue)網絡(luo)所調控的(de)(de)復(fu)雜(za)動(dong)態(tai)連續性(xing)(xing)生(sheng)(sheng)物學(xue)過程。
為了更好的(de)(de)研究巨噬(shi)細胞功(gong)能，設計研究實(shi)驗(yan)時(shi)，要在時(shi)間(jian)上（疾病(bing)的(de)(de)發(fa)生和發(fa)展）和空間(jian)上（病(bing)灶(zao)的(de)(de)原(yuan)位，組織(zhi)，器官(guan)）考慮到巨噬(shi)細胞的(de)(de)起(qi)源，更新，補(bu)充，形態(tai)，表型和功(gong)能的(de)(de)連續(xu)性(xing)，動(dong)態(tai)性(xing)和網絡性(xing)。
Q1.為什么Clodronate Liposomes（氯(lv)膦(lin)酸二鈉脂質體(ti)）是研(yan)究巨(ju)噬細(xi)胞功能(neng)的利器？
A1：巨(ju)噬(shi)細胞在免疫(yi)系(xi)統中(zhong)發揮重要作用。它們主要通過可溶(rong)性分(fen)子(zi)，如細胞因子(zi)和趨化因子(zi)的(de)介導來調節許多非吞噬(shi)細胞的(de)功能。巨(ju)噬(shi)細胞還通過攝取和消化微(wei)生物(wu)或(huo)非自身(shen)顆粒和大分(fen)子(zi)參(can)與身(shen)體(ti)的(de)“穩(wen)態”。內吞物(wu)的(de)消化是由其溶(rong)酶體(ti)酶介導的(de)。
脂(zhi)質體是(shi)人工制備的(de)脂(zhi)質囊泡，由(you)夾帶水性隔室的(de)同心磷脂(zhi)雙層組成。它們可用于包封溶解在水溶液中(zhong)的(de)強親水性分子，例如氯膦酸(suan)鹽，一種為人類(lei)應(ying)用開發(fa)的(de)無(wu)毒二膦酸(suan)鹽。
注射后，氯(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)脂(zhi)質(zhi)體(ti)起(qi)到特洛伊木馬的(de)作用。巨(ju)噬細(xi)(xi)胞攝取氯(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)脂(zhi)質(zhi)體(ti)并消(xiao)化脂(zhi)質(zhi)體(ti)膜。氯(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)不會(hui)(hui)被消(xiao)化，并會(hui)(hui)留在(zai)巨(ju)噬細(xi)(xi)胞內。更(geng)多氯(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)將在(zai)巨(ju)噬細(xi)(xi)胞中(zhong)積聚(ju)，因為它會(hui)(hui)攝取和消(xiao)化更(geng)多的(de)氯(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)脂(zhi)質(zhi)體(ti)。當氯(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)在(zai)細(xi)(xi)胞內聚(ju)集(ji)到一定的(de)濃(nong)度后，氯(lv)(lv)膦(lin)酸(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)會(hui)(hui)通過啟動(dong)其程序性細(xi)(xi)胞死亡即細(xi)(xi)胞凋(diao)亡來清(qing)除巨(ju)噬細(xi)(xi)胞[1]。
通過選(xuan)擇氯膦(lin)酸(suan)鹽脂(zhi)質體的正確給(gei)(gei)藥途(tu)徑，給(gei)(gei)藥時間點，給(gei)(gei)藥頻率和給(gei)(gei)藥部(bu)位(wei)，可以清除(chu)特(te)定器官或組織(zhi)中的巨(ju)噬細胞。因此，氯膦(lin)酸(suan)鹽脂(zhi)質體是(shi)研究巨(ju)噬細胞功能的極好工具[2]。
Q2.Clodronate Liposomes（氯膦酸(suan)二(er)鈉脂(zhi)質(zhi)體）和Clodronate（氯膦酸(suan)二(er)鈉）的半衰期(qi)是多少？
A2：死亡巨噬(shi)細胞釋放的氯(lv)膦(lin)酸(suan)鹽的半(ban)衰期（t1 / 2）為數分鐘[3]，因為游(you)離(li)氯(lv)膦(lin)酸(suan)鹽通(tong)過(guo)腎臟(zang)系統迅速從(cong)循環中(zhong)被清除。 由于難(nan)以通(tong)過(guo)細胞膜，游(you)離(li)氯(lv)膦(lin)酸(suan)鹽分子不易進(jin)入細胞，包括脂質體磷脂雙分子層(ceng)。 然而，如(ru)果它們留在周(zhou)圍(wei)的介質中(zhong)，它們可能會(hui)慢慢積聚到細胞中(zhong)[4]。
氯(lv)膦(lin)酸鹽脂質(zhi)體的半衰期很難(nan)確定(ding)。 脂質(zhi)體難(nan)以從(cong)血液中分離，并且它(ta)們在動物(wu)中的分布不均勻。 此外，氯(lv)膦(lin)酸鹽脂質(zhi)體的半衰期取(qu)決于巨噬細胞攝取(qu)和消化所需(xu)的時間，這由許(xu)多因(yin)素決定(ding)，例如：動物(wu)疾病模型的免(mian)疫全能性(xing)，給藥途徑(jing)，給藥劑量(liang)。
Q3.實(shi)驗清除(chu)巨噬(shi)細胞不成功(gong)，可能的原因有哪些(xie)？
A3：氯膦酸(suan)鹽脂(zhi)質(zhi)體活性的失(shi)敗(bai)可能是由于各種原因：
1）有效期已過：超過有效期后無法確保活性;
2）在(zai)極(ji)端(duan)溫(wen)度(du)(du)下儲(chu)存：氯(lv)膦酸鹽脂質(zhi)體(ti)應儲(chu)存在(zai)4到8攝氏(shi)度(du)(du)之間。冷凍脂質(zhi)體(ti)或(huo)溫(wen)度(du)(du)高于(yu)30攝氏(shi)度(du)(du)會影響膜(mo)的(de)穩定性(xing)并降低氯(lv)膦酸鹽脂質(zhi)體(ti)活(huo)性(xing);
3）脂質(zhi)體(ti)懸(xuan)浮液的(de)(de)稀釋：這(zhe)會影(ying)響懸(xuan)浮液中(zhong)的(de)(de)滲透壓，這(zhe)可能(neng)導致(zhi)脂質(zhi)體(ti)膜的(de)(de)不穩定;
4）給藥方案不合理：給藥方案應仔細選擇并考慮多種因素，例如：
a.打算消耗的巨噬細胞的類型（例如庫普弗細胞，小膠質細胞，肺泡巨噬細胞，破骨細胞）。例如，可以通過氣管內給藥靶向肺泡巨噬細胞，而內皮/上皮屏障另一側的間質巨噬細胞不會被該給藥途徑靶向;
b.是否打(da)算短期或長期消耗它(ta)們;
c.動物的體重：較大的動物需(xu)要更多的氯膦酸鹽脂質(zhi)體才能達到清除閾值。
5）脂(zhi)質(zhi)體懸浮液(ye)(ye)在(zai)使(shi)用前未重(zhong)新懸浮：脂(zhi)質(zhi)體在(zai)儲存期間傾向于(yu)沉淀，確(que)保在(zai)使(shi)用前輕輕搖動重(zhong)懸，以防(fang)止(zhi)僅注射(she)不含(han)脂(zhi)質(zhi)體的PBS溶液(ye)(ye);
6）注射時出錯：確保注射是否成功非常重要。例如，如果您在尾靜脈注射期間看到鼓包形成，則可能是您注射到皮膚組織了，沒有注射到靜脈里。當腹膜內注射時，確保將脂質體懸浮液注射到腹腔內（而不是在腸內）。為了驗證脂質體是否已到達您想要的位置，可以使用熒光Dil脂質體;
7）檢驗清(qing)除的手段是(shi)否正(zheng)確：需要選擇正(zheng)確的標記來確定清(qing)除是(shi)否成功(gong)。此外，您需要考慮到(dao)每(mei)種給藥(yao)方案和(he)（動(dong)物）模型的巨噬(shi)細(xi)胞的消耗和(he)再增(zeng)殖動(dong)力學(xue)不同(tong)。
Q4.實(shi)驗動物在注射(she)后立(li)即死亡(wang)，可能的(de)原因有哪(na)些？
A4：這很可(ke)能(neng)是由于注(zhu)射了非均質的(de)沉(chen)淀(dian)(dian)脂質體。 沉(chen)淀(dian)(dian)的(de)脂質體可(ke)引起(qi)栓塞(sai)，從而部分或(huo)完(wan)全阻斷動脈或(huo)靜脈中的(de)血流。 由于脂質體在(zai)儲存期間容易沉(chen)淀(dian)(dian)，因(yin)此請確保在(zai)使用(yong)前顛(dian)倒混勻。
另(ling)一個原因(yin)可能是脂質體懸浮液的溫(wen)度。 脂質體應儲存在4到(dao)8攝氏度之間，但(dan)應平衡到(dao)室溫(wen)后給(gei)藥。
注意：如果注射需要較長，脂質體可能在注射器中沉淀，當使用相同的注射器注射多只動物時，這可能導致差異劑量。
Q5.實(shi)驗動物在注(zhu)射后數小(xiao)時或者數天死(si)亡，可能的原因是什(shen)么？
A5：這(zhe)很(hen)可(ke)能是(shi)由注(zhu)射(she)前或注(zhu)射(she)過程中(zhong)的微生物(wu)污染(ran)引起的。當注(zhu)射(she)氯膦酸鹽脂(zhi)質體(ti)時，巨噬細(xi)胞的清除可(ke)使動物(wu)更容易受(shou)到感染(ran)，尤其是(shi)免疫缺陷動物(wu)。
Q6.如何存(cun)儲(chu)脂質體(ti)懸(xuan)液？
A6：儲(chu)存(cun)在4-8oC（或39-47oF）之間。 脂質體懸(xuan)浮(fu)液(ye)不(bu)應(ying)該冷(leng)凍(dong)，也不(bu)應(ying)暴(bao)露在極端高(gao)溫下。
Q7.氯膦酸二鈉脂質體懸液的濃度是(shi)多少？
A7：平均而言，整個脂質體懸浮液的濃度為5mg氯膦酸鹽/ mL。 氯膦酸鹽以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂質體囊泡中。
Q8.脂質體的粒徑和(he)電荷是多少？
A8：所有(you)的(de)脂質(zhi)體(ti)（即氯膦酸鹽，PBS和熒光Dil脂質(zhi)體(ti)）都(dou)帶有(you)輕微(wei)帶負電，因(yin)此(ci)不會聚集(ji)在一起。 懸浮液中的(de)脂質(zhi)體(ti)沒有(you)按特定的(de)粒(li)徑截留，脂質(zhi)體(ti)的(de)大(da)小(xiao)不等(deng)（最大(da)3微(wei)米）。 平均而(er)言(yan)，脂質(zhi)體(ti)的(de)大(da)小(xiao)為1.7微(wei)米。
Q9.溶解脂質體的緩沖液是什(shen)么？
A9：所有的脂(zhi)(zhi)質體(ti)制劑（即氯膦酸鹽(yan)脂(zhi)(zhi)質體(ti)，對照脂(zhi)(zhi)質體(ti)和(he)熒光(guang)Dil脂(zhi)(zhi)質體(ti)）懸浮于無菌磷(lin)酸鹽(yan)緩沖鹽(yan)溶液（PBS）：10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4，>140mM NaCl中。
Q10.如何檢測熒光Dil脂質(zhi)體(ti)？
A10：用熒光(guang)染料DiI標(biao)記(ji)的(de)脂質體，作為對照，可用于研究脂質體是否已通過(guo)所選的(de)給藥方案達(da)到(dao)靶向的(de)巨(ju)噬細胞(bao)群。 熒光(guang)標(biao)記(ji)將顯(xian)示脂質體在組織內的(de)分布(bu)模式及其對巨(ju)噬細胞(bao)的(de)攝(she)取。 Dil標(biao)記(ji)的(de)脂質體可以通過(guo)流式細胞(bao)術(shu)和熒光(guang)顯(xian)微(wei)鏡檢測(ce)。 DiI分子(zi)的(de)激(ji)發和發射分別(bie)為549和565nm。
Q11.發表研究(jiu)成果時，如何引用LIPOSOMA的產品(pin)？
A11：當用(yong)(yong)(yong)LIPOSOMA的(de)脂質(zhi)體制劑用(yong)(yong)(yong)于實驗并(bing)打算發表研究成果時，引用(yong)(yong)(yong)格式：“LIPOSOMA，the Netherlands（clodronateliposomes.com）”。
參考文獻：
1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.
2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.
3. Fleisch, H. (2000). Bisphosphonates in bone disease: from the laboratory to the patient. Elsevier.
4.Claassen, I., Van Rooijen, N., & Claassen, E. (1990). A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogeneous cell populations in vitro, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. Journal of immunological methods, 134(2), 153-161.
